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作者：蚍蜉玉 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 今天要分析的题目为：Autophagy protein p62/SQSTM1 is involved in HAMLET-induced cell death by modulating apotosis in U87MG cells由题目可将文章由外向内一一拆卸开来。（回复170918可下载，一周有效） 第一部分也是主体的部分即HAMLET诱导U87MG细胞死亡；第二U87MG细胞死亡的过程是P62蛋白参与的；第三P62蛋白是通过细胞自噬和凋亡的形式参与的。那么就一起来看看p62蛋白是如何挑起自噬与凋亡的大梁的吧！ 知识背景介绍 P62是众所周知的自噬蛋白，也称为SQSTM1蛋白，可在肿瘤细胞中发挥自噬与凋亡的作用。包括4个结构域，分别是PB1，TB，LIR，UBA。其中LIR结构域负责与自噬受体蛋白 Atg8/LC3结合。UBA结构域是可以招募泛素化蛋白，尤其是当蛋白被暴露在氧化剂和蛋白酶体抑制剂时。 HAMLET 是一种药物，能够诱导细胞死亡。 HAMLET能够在U87MG细胞中诱导细胞自噬 第一：HAMLET药物作用U87MG细胞后，MTS显示HAMLET处理的浓度越高细胞活性越低，处理时间越久细胞活性越低，表明HAMLET作用U87MG细胞具有剂量和时间依赖性。 第二：探讨是否HAMLET是通过激活自噬途径促进细胞死亡。采用荧光GFP-LC3作为自噬小体的标记物进行免疫荧光染色单标实验，结果显示在HAMLET处理细胞3h时有55%的GFP-LC的标记，表明其激活了细胞自噬。 第三：电子显微镜结果显示HAMLET处理后，细胞双脂质膜层出现了自噬小体囊泡，表明在HAMLET200ug/ml作用后，细胞出现了自噬的现象。 HAMLET导致的u87MG细胞死亡与P62蛋白相关 第一：HAMLET作用U87MG细胞后观察P62蛋白的水平，蛋白结果表明其作用细胞后短暂增加了P62的蛋白表达水平。 第二：免疫荧光定位分析在HAMLET处理100ug/ml和200ug/ml时，GFP-LC3和P62蛋白共同定位与细胞中。 如何验证HAMLET诱导的U87MG细胞发生自噬 为了探索是否自噬是因为HAMLET诱导的细胞毒性引起的，课题组使用了Atg5、3MA、EBSS、雷帕霉素细胞自噬抑制剂进行一一验证，如下: 在U87细胞中敲减Atg5后，HAMLET处理200ug/ml后，P62的蛋白水平升高，但是细胞活性下降达到13%。 在U87细胞中敲减3MA后，HAMLET分别处理100ug/ml和200ug/ml后，增加了P62的蛋白水平，但是降低了细胞活性分别达到14%和40%。 在U87细胞中使用EBSS饥饿以后，HAMLET处理200ug/ml后，增加了P62的蛋白水平，降低了细胞活性达到63%。 当用2.5mmol/l 雷帕霉素处理后减少了P62的蛋白水平，HAMLET处理后，而且细胞活性增加达到12-16%。 P62蛋白水平变化对HAMLET诱导细胞自噬的影响 既然已经发现HAMLET能够诱导细胞发生自噬，而且P62蛋白参与其自噬的过程，那么P62蛋白水平的变化会影响到HAMLET诱导细胞自噬的程度吗？ 第一：课题组设计了过表达和敲除P62蛋白的质粒转染入U87细胞，检测在用HAMLET处理观察其药物毒性的变化。结果表明敲除P62组削弱了HAMLET药物的毒性，过表达P62组增强了HAMLET药物的毒性。
第二：将U87细胞转染GFP标记的P62蛋白，然后用HAMLET药物处理1.5h后，结果发现HAMLET增加了细胞间的P62蛋白集聚。
HAMLET诱导CASPASE8调节胶质瘤细胞U87发生凋亡 第一：早期的HAMLET研究中其是与P62导致的凋亡相关的。为了检测P62蛋白在凋亡上的功能是与细胞凋亡相关，课题组初次使用了钙黄素-AM染色来动态的调节HAMLET诱导的细胞死亡。然后结果发现在HAMLET处理的6-12h以内细胞开始大部分的死亡。用TUNNEL试剂盒检测HAMLET100ug/ml处理的12h时出现了密集的细胞凋亡。
第二：作者假设该细胞程序性的死亡是与caspase-8炎性级联相关，因此采用蛋白了实验，验证出在用HAMLET诱导细胞时，caspase-8激活。 第三：为了进一步验证caspase-8与此相关，课题组实施了caspase-8的抑制剂AC-LETD-CHO或者 z-VAD-FMK，结果发现AC-LETD-CHO或者 z-VAD-抑制了 HAMLET诱导的细胞死亡。
第四：课题组还分析了caspase-8的活性成分，亚基P18，和分裂的caspase-9。发现p18与P62有紧密的关系，而P62与caspase-9却关系较少。在HAMLET处理胶质瘤细胞u87时，caspase-8比caspase-9更有激活的效果。
P62蛋白的UBA结构域的突变消减了HAMLET诱导的细胞死亡 P62蛋白的c末端能够与泛素化蛋白结合包括多样性泛素化蛋白caspase-8.因此，课题组构建了P62的UBA结构域突变的过表达质粒，携带GFP绿色荧光标签，将其转染入U87细胞内。而与野生型（CT）的P62质粒转染人U87相比，突变型的P62显著减少了细胞死亡，而且caspase-8和亚基P18的表达也减少。
自噬途径的抑制促进了HAMLET诱导的细胞凋亡，反而自噬途径的激活减弱了这一过程。与此同时，课题组发现p62的过表达能够激活caspase-8，并且促使HAMLET诱导的细胞凋亡；p62表达水平降低则结果与此恰好相反。 课题组更深一步证实P62蛋白因HAMLET处理而变化与其C末端的UBA结构域相关。因此这些结果表明P62蛋白除了是自噬激活的标记物之外，也可以作为一个重要的激活caspase-8细胞凋亡的调节器。 以上就是文章的主要内容，亲爱的们，一个挑起自噬与凋亡的蛋白有没有也想赶快去在你的细胞里试验试验呢。。。。
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