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上次看了「一文教你看懂 PCR 结果图」的童鞋是不是迫不及待得等待后续的更新呢？哈哈，别急，这次我就跟大家详细介绍 Q-PCR 的计算原理及过程。绝对干货哦！ PCR 扩增的速率大家都知道，就是简单的指数增长，也就是 1 变 2，2 变 4，4 变 8 以此扩增。数学形式就是 2 的 ct 次方，但是实际过程中的增量应该是（1+e）的 ct 次方，e 是扩增效率也称扩增系数。一般我们都假设 e 为 1。正常的 Q-PCR 我们都会有一个阈值，也就是我们平常说的平台期。
 简单的说在平台期的所有基因扩增的数目是一致的。而唯一有区别的则是 ct 值的不同。Ct 值的含义是：每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数 (cycle)。所以不难推断出 ct 值越小，反应扩增到达平台期所需循环数越少，目的基因起始含量越高。下面我们用一个公式进行推导过程：（敲黑板，重点！） PCR 产物量 = 2∧ct * 起始模板量 起始模板量 = PCR 产物量／2∧ct = 起始模板量 * 2∧ - ct 可以得出以下两个等式： 待检基因起始模板量 = PCR 产物量 * 2∧ - ct（待检基因） 内参基因起始模板量 = PCR 产物量 * 2∧ - ct（内参基因） 由于 PCR 产物量是相同的。两式上下相除得： 待检基因起始模板量／内参基因起始模板量 = 2∧-【ct（待检基因）-ct（内参基因）】= 2∧-Δct 上述的算式结果数值只能表示该待检基因在该处理组中相对于内参的表达量，没有任何意义。想要有看出基因的变化趋势，则需要与空白处理组的待检基因起始模板量/内参基因起始模板量进行比较，两者相除，如果比值大于 1，则表明该基因处理后上调，如果比值小于 1，则表明该基因处理后表达下调。而两者相除的结果就是我们经常说的 -ΔΔct。 明白了原理，下面我们进行计算（这里以 p53 基因为例进行计算）： 1. 数据的输出。选择 Export data（注意一定要选中样品空后再进行输出，不然可能输出的就是空白样品） 2. 在这里，我们需要三组信息，样品组，基因组，以及对应的 CT 值组 3. 首先我们按照下列表格进行排列 4. 然后计算每组内参 GAPDH 均值 5. 我们首先计算第一个 Δct，即每组的待检基因减去内参基因的 CT 值 6. 计算空白组的 Δct 均值 7. 样品组的 Δct 减去空白组的 Δct 均值，得到 ΔΔct 8. 计算结果
在这里要说明下实际上的产物量并一定是「2 为底数」而是「（1+e）的 ct 次方」，只有扩增效率接近于 1 的时候才可以用 2 为底数。关于扩增效率 e 的计算由于篇幅有限下次再解释哈，有迫切需求的童鞋可以自行网上搜索，另外本文还提供了可以计算 e 值的相关软件，LinRegPCR 软件。生物学霸后台回复 「软件 006」即可。 好了， 看到这大家应该都可以理解如何计算 Q-PCR 数据，并且计算的原理了吧。希望能在科研上对大家有所帮助！ 封面题图来源：丁香通 |
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