(一)常规病理学诊断
常规病理标本的诊断包括大体检查和显微镜下检查。
1.大体检查:
标本的大体观察非常重要,应详细记述标本大小、形状、表面和切面颜色、质地、病变部位、大小、形状、有无干酪样坏死和钙化,有无空洞、空洞大小和数量、洞壁厚度、内壁是否光滑等。典型的大体标本呈灰黄色,质地细腻且形似奶酪的坏死组织(干酪样坏死),对结核病的诊断具有提示作用。随着微创技术在临床的广泛应用,目前病理标本大多为内镜活检、穿刺活检和细针吸取的小标本,缺少手术切除标本的大体观察,病理科医生在诊断中要谨慎,防止漏诊或误诊。
2.镜下检查:
显微镜下结核病病变通常为坏死性肉芽肿性炎,但亦可为非坏死性肉芽肿性炎。典型的病变是肉芽肿伴干酪样坏死,外周有纤维结缔组织和慢性炎症细胞浸润,病变周边可见朗格汉斯巨细胞[6]。结核病的基本病理变化主要为渗出性病变、增生性病变和坏死性病变,这3种病变可以共存,随机体抵抗力、对MTB的变态反应强度、MTB的菌量及毒力强度而相互转化[4]。
需要注意的是,结核病的大体观察、组织学表现及细胞学表现虽然具有一定的特异性,但所有上述表现亦可出现在其他感染性和非感染性肉芽肿性病变中。所以常规的病理学诊断手段并非结核病诊断的金标准,必须通过其他辅助检查找到结核病病原学依据方可确诊。
(二)特殊染色
1.抗酸染色:
抗酸染色是诊断结核病最常用的特殊染色方法。由于MTB的细胞壁内含有大量脂质,包围在肽聚糖的外面,所以分枝杆菌一般不易着色,要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后很难被酸性脱色剂脱色,故名抗酸染色。最经典的抗酸染色方法是萋尼(Ziehl-Neelsen)染色法,现多用改良法。油镜下MTB一般呈红染的两端钝圆稍弯曲的杆状,有时呈串珠状。抗酸杆菌多见于坏死的中心区或坏死区与上皮样肉芽肿的交界处。
抗酸染色需要注意以下几点:(1)除MTB外,麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae)和非结核分枝杆菌(non-tuberculous mycobacteria,NTM)也是抗酸阳性杆菌,肉眼很难分辨,需要进一步进行分子病理检测或分枝杆菌培养加以鉴别。(2)除分枝杆菌外,诺卡菌属(Nocardia)及军团菌属(Legionella)部分细菌也可呈抗酸染色阳性,应注意鉴别[7,8]。(3)抗酸阳性率一般较低,抗酸阴性不能否定MTB的存在。对于临床高度怀疑结核病的组织标本可适当制成厚切片(如10 μm)进行抗酸染色,以提高阳性检出率。(4)NTM是一类环境分枝杆菌,主要源于污水、土壤及气溶胶等,是造成抗酸染色假阳性的重要污染源。如抗酸杆菌出现在非结核病病变区、组织外的玻片空白区或与组织不在同一个水平面时,需排除污染造成的假阳性。(5)每次进行抗酸染色时需设阳性对照。阅片需使用高倍镜和油镜,当高倍镜未发现阳性菌时,须使用油镜检查,以防假阴性。
2.网状纤维染色:
该染色显示组织结构是否完整、坏死的范围和程度。凝固性坏死中网状纤维明显减少,在干酪样坏死中可完全消失。由于干酪样坏死对于结核病具有一定的诊断价值,而仅通过HE染色对于坏死性质的判定可能出现一定的偏差,所以网状纤维染色对结核病的诊断和鉴别诊断有一定的帮助。
3.六胺银(GMS)及过碘酸盐希夫(PAS)染色:
真菌病是除结核病外最为常见的感染性肉芽肿疾病。真菌病和结核病有时很难通过HE染色鉴别。诊断真菌病需要在病变区找到真菌病原体。GMS染色和PAS染色是最常用的识别真菌的染色方法。这2种特殊染色虽然对于直接诊断结核病没有太大的价值,但却可起到与真菌病进行鉴别诊断的作用,有效防止误诊。
4.金安罗丹明染色:
与传统的抗酸染色法相比,金安罗丹明染色后抗酸杆菌会发出黄绿色荧光,在暗视野下更醒目,且可以在高倍镜下观察,不需要用油镜。该方法与抗酸染色法相比操作和检测更方便,检出率更高。但该方法需要紫外光源,较难对抗酸杆菌进行定位,同时荧光染色片无法长期保存。
(三)免疫组织化学染色
免疫组织化学法(IHC)是利用抗原-抗体的特异性结合反应原理,以抗原或抗体检测和定位组织中目标蛋白质的一种技术方法。结核病IHC染色主要使用两种类型的抗体,第一种类型是针对不同细胞类型的抗体,如抗CD68抗体可帮助区分类上皮细胞与上皮来源细胞,有助于确认肉芽肿结构,但对于结核病的诊断价值有限。第二种类型是针对MTB特异抗原的抗体,这类抗体可在组织切片中显示MTB蛋白的表达,对结核病的诊断有帮助。目前报道的抗体主要识别BCG成分、MPT64、PstS1及Ag85B等抗原[9,10,11,12]。免疫组织化学检查操作简便,阳性信号易于观察,不需要使用油镜,可以有效提高敏感度和工作效率,但尚无可应用于临床诊断的第二种类型IHC抗体及结核病IHC的判读标准,需要开展更多的临床转化及评估研究。
(四)分子病理学检测
近年来,分子病理学检测技术发展迅速。基于基因检测的分子病理新技术具有简单、快捷、特异、敏感及快速等优点,可有效提高组织标本中MTB的检出率,可帮助鉴别结核病与非结核分枝杆菌病,还可以帮助诊断耐药结核病,为结核病病理学精准诊断提供了更多的辅助手段。目前常用的技术如下。
1.实时荧光定量PCR技术:
实时荧光定量PCR(realtime fluorescence quantitative PCR)主要原理是通过荧光染料或荧光标记的特异性探针,对PCR产物进行标记跟踪,实时在线监控反应过程,结合相应软件对产物进行分析。该技术是目前临床应用最为广泛的分子病理检测技术,其主要优势在于操作简便、成本低廉、快速及敏感等。MTB特异序列IS6110是目前最常用的检测靶点,该序列只存在于MTB复合群,且是多拷贝,对于结核病诊断的敏感度和特异度较高,可用于鉴别诊断结核病与非结核分枝杆菌病[13,14]。
2.核酸杂交技术:
核酸杂交(nucleic acid hybridization)技术主要原理是与探针(probe)具有一定同源性和互补性的待测核酸分子在一定的条件下,可与探针通过氢键形成双链分子。这种双链分子经过同位素、荧光物质或生物素标记后,可通过放射自显影或显色反应检测出来。该技术比PCR技术具有更高的检测通量,一次实验可以检测多个基因位点。由于NTM种类繁多,而不同非结核分枝杆菌病治疗方案不尽相同,因此该技术在分枝杆菌菌种鉴定中具有独特优势。另外,该技术可以实现一次检测多种抗结核药物的耐药相关基因突变,如通过检测rpoB基因突变筛选利福平耐药的MTB,通过检测katG、inhA、ahpC等基因突变可筛选异烟肼耐药的MTB等[15,16]。
3.高分辨熔解曲线技术:
高分辨熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术主要原理是双链核酸分子热稳定性受其长度及碱基组成的影响,序列变化会导致升温过程中双链核酸分子解链行为的改变。由于所用的荧光染料只能结合双链核酸分子,因此通过实时检测双链核酸分子熔解过程中荧光信号值的变化,再借助专业性的分析软件,可以检测待测核酸分子的序列多态性。其特点是敏感度高、可检测单碱基差异、成本低且闭管操作等。该技术也可应用于分枝杆菌菌种鉴定及耐药结核病的诊断[17,18]。
PCR的分子病理检测技术敏感度很高,外源DNA的污染容易造成假阳性,需要注意以下几点:(1)分子病理检测需在符合国家标准的临床基因扩增实验室中,由受过专门培训的专业人员按照规范化操作规程进行,以保证检测结果的准确性。(2)每次实验需设置阳性与阴性对照。(3)当检测结果出现阴性时,不能排除由于病原菌数量低于检测限值而引起的假阴性结果。(4)实验耗材尽量使用无核酸、无核酸酶、无菌的一次性用品,尽量使用带滤芯吸头,防止气溶胶对加样器的污染。(5)建议分子病理检测使用专属切片机,不与其他常规切片机混用。每个标本应使用独立刀片进行切片,以防交叉污染。(6)准备用于分子病理检测的白片应参照(5),同时注意捞片机中使用洁净水。