|
在接下来的时间里，我将分别介绍以下三个部分，Duchenne Muscular Dystrophin，也就是DMD的临床；机制，包括基因和编码产物蛋白质；然后介绍诊断策略；最后一部分是治疗方案，包括最新的治疗进展 我们知道有很多病以人名字来命名，是为了纪念这位医生。DMD就是为了纪念Duchenne医生，他是法国人，神经内科的先驱，主要活跃在19世纪，发展了肌电图，医学照相，组织活检等多项技术。大家是不是觉得，Duchenne医生一定报道了第一个病例吧？这样我们才纪念他。其实不是。历史上，第一个DMD病例其实是由两位亚洲尼泊尔医生首先报道的。为什么这两位医生在医学史上没能够留下他们的姓名。反而是十几年后的Duchennne更广为我们所知呢，第一个原因是当时的法国是医学，尤其是神经内科的研究中心，Duchenne的研究引起了更多人的关注，另一个原因是因为Duchennne医生进行了非常详细，并且直观的报道。 这张照片就是Duchenne报道的病人，一个典型的DMD男孩。DMD是最常见的罕见病了，报道的发病率在每3000到6000个男孩中就有一个病人。一般起病年龄在2岁到6岁之间，发病之后肌力是明显弱于同龄人，不加以治疗的话，到了青春期就只能依靠轮椅来活动了。由于肌肉细胞被不断地破坏，CK的水平是非常高的。 对于这样一个比较常见的罕见病，早期认识DMD就非常重要了。如果我们在门诊遇到发育迟缓，迟迟不会走路的几岁男孩，或者高尔征阳性，或者步态异常或肌力很弱，小腿肌肉异常肥大，再检查发现CK水平很高，就应该高度怀疑DMD，进行下一步检查。 DMD是由dystrophin基因变异导致的遗传病。这个基因位于X染色体的短臂，是一个很大的基因，约有2.4 兆碱基对。每一个蓝色的方格代表这一个外显子，一共有79个外显子。外显子的弧线或者直线，表示着氨基酸编码阅读框的顺序。 DMD的遗传方式符合伴性遗传，也就是X连锁的隐性遗传。一个家庭中的DMD患病男孩，我们称之为先证者。由于女性有两个X染色体，所以母亲叫做携带者。而男性由于只有一个X染色体，如果这个拷贝有变异，比如这位先证者，就会发病。而如果儿子没有从母亲那里遗传到这个有变异的X染色体，那么他就是正常的，不发病。 dystrophin这样一个巨大的基因，编码的产物也不只有一种，有长有短。最长产物的Dp427就有骨骼肌，心肌，浦肯野纤维这三种不同的转录本。稍微短的一些产物分布在其他不同的组织，例如视网膜，脑部。所以，这也是为什么DMD会影响心脏以及DMD患者也可能出现神经发育问题的生理基础。更短的一些产物还需要我们进行进一步的研究。 我们已经知道Dystrophin基因是很大的一个基因，相应的， Dystrophin蛋白也是很大的一个蛋白，有427k道尔顿。这个蛋白位于肌细胞膜的内侧面，一侧连接在actin肌动蛋白上，另一侧连接着肌细胞膜上的蛋白质复合体，通过这个蛋白质复合体固定在细胞外基质上。另一方面，dystrophin连接着细胞骨架 microtubules。在肌肉的收缩过程中，发挥稳定细胞结构的作用。我们可以把Dystrophin看成稳定船的锚绳。 DMD疾病呢，就是这个锚绳断开了，船无法被有效地固定起来。 接下来我们来了解一下都有哪些致病突变会导致锚绳断开。这个图表基于eDystrophin网站的统计，我们看到，绝大部分的DMD都是由片段缺失，也就是deletion导致的，占到了64% ，片段重复占到了超过21%。由于片段的缺失或者重复，导致编码氨基酸的编码框的阅读位置被改变，这样翻译出的多肽链的氨基酸顺序和正常的顺序完全不同，翻译也提前终止，这样的dystrophin蛋白就丧失了正常功能。 有些DMD是由无义突变，英文叫做nonsense导致的。由于这个提前出现的终止密码子，dystrophin蛋白的翻译被提前终止了，这样的不成熟产物既没有功能，也更加不稳定，更容易被细胞降解掉。 Dystrophin蛋白缺失导致DMD的病理机制是一个很复杂的表格。我们还是用锚绳断开这个模型来帮助理解。普通人的肌肉由于有这个锚绳的固定作用，肌肉细胞能够正常收缩，我们可以进行正常的行走，运动等等。DMD病人由于这个锚绳的断开，普通的肌肉收缩比如呼吸、走路，对他们来说就会导致肌肉损伤，从而引发炎症反应、肌肉纤维化、反复破坏与再生等一系列的反应，最终导致肌肉不具备正常的收缩功能。 如果锚绳没有断开，而只是缩短了呢？这就是Becker型肌营养不良。Duchenne型患者是完全缺失正常功能的Dystrophin蛋白。Becker型患者，Dystrophin蛋白一般存在部分功能的. 相对于Duchenne型，Becker型患者起病比较迟，一般是儿童期，也有到成年期才发病的，病情进展也更加缓慢一些，20岁之后才需要依赖轮椅，当然也有不需要依赖轮椅的。由于肌肉损伤没有那么严重，CK升高一般在5倍左右。除了Duchenne，Becker这两种影响骨骼肌的疾病之外，dystrophin还可能会仅仅影响心脏，也就是DMD相关性扩张性心肌病
我们一般认为女性携带者不发病。一项2016年的研究调查了15位携带者，8位没有临床症状，仅仅有CK升高，另外7位有轻微的症状，比如：肢带肌力下降，步态异常，运动不耐受。也有携带者肌电图有异常的。
和大家分享一下我自己的一个病例。这是个11岁女孩，没有临床症状，体检发现CK升高。肌活检提示Calpain3蛋白可疑性降低，所以他们去进行了CAPN3基因测序，结果是正常的。接着父母和孩子来我们这里做全外测序分析，我们找到了一个DMD基因上的 de novo无义突变。所以最后我建议治疗医生回头去确认一下肌活检，同时这个女孩长大了之后如果生育男孩的话，也是有DMD的患病风险的。
在疾病的机制环节，我们了解了DMD是X染色体上的基因，dystrophin蛋白位于肌细胞膜内侧，发挥锚绳类似的固定作用。也了解了Duchenne型，Becker型肌营养不良的不同，以及女性携带者。探讨完了机制，接下来进入诊断环节。我们可以在基因水平检测，也可以在蛋白水平检测，请问各位，大家觉得哪一种方法应该是首选呢？ 这个答案其实一直都在变化。在测序普及之前，传统的检测方法一直是肌肉活检。从患者身上取一块肌肉下来，在实验室里进行组织固定，切片。 诊断金标准是免疫组化，进行抗dystrophin抗体染色。我当时的实验室有4种不同的抗体，针对不同的结构域都要做。左边的是正常的肌肉切片，我们可以看到清晰的肌纤维，形态是正常成簇的。右边的是DMD肌肉切片，dystrophin蛋白是明显缺失的，肌纤维的形态也不是正常状态。 随着NGS时代的来临，基因检测走进了临床实践。这个诊断步骤取自2010年发表的DMD诊断指南。我们看到，怀疑DMD，可以跳过肌活检直接进行基因检测，基因检测的方案呢，首先进行片段缺失与重复的分析，阴性结果的话，进行下一步的测序分析。如果发现了致病变异，诊断确定，不需要再进行活检了。而反之，肌活检确定了蛋白异常，基因检测则是必须的步骤。 随着技术的进步，我们实际上可以不再遵守先缺失与重复分析，再进行基因测序的步骤。NGS测序的数据，在保证足够的测序深度的情况下，是可以提示片段缺失的。我自己在工作中就这样发现了好几例，最终MLPA也验证了病人的片段缺失。MLPA方法是检测片段缺失与重复的金标准。为什么我在这里和大家讨论未来NGS与MLPA的顺序互换呢？费用Money~很多DMD的孩子，家境困难。由于国情所限，费用问题常常是我们医生在临床上需要面对的实际问题。MLPA作为金标准，试剂是MLC Holland公司的专利产品，费用不低。而NGS测序的费用逐年下降。因此，在可以预见的未来几年，我个人相信，也期望NGS测序数据能够为诊断片段缺失与重复发挥更大的作用。 那么现在问题来了，病人确诊了DMD，应该如何治疗呢？ 在谈治疗方案之前，我们先来关心一下费用。2017年一篇文章的表格给我们提供了发达国家的数据。我们看到像德国，意大利，英国美国这些国家，一个病人一年的费用都在几万。这还只是直接的像药费，护理费这些，不包括家庭护理的负担。大家都是临床医生，根据大家经验，这个病每年费用是多少呢？希望有经验的老师等会可以和我们分享一下。 具体的治疗我们需要参考TREAT-NMD的指南。TREAT-NMD是欧盟支持的一个专注于神经肌病的知识库，提供像DMD，SMA，CMD等等病的诊断指南，家庭护理指南，研究进展等一系列的知识。对神经肌病有兴趣的老师可以经常关注一下这个网站。DMD有2010年发表的很系统的治疗指南，可以在他们的网站上查看英文全文。也有一个简略版本，归纳了诊治要点 。协和医院的戴毅老师把它翻译成中文。
最重要的几点包括：第一，参加患者肌病组织，从组织中获得支持和帮助。我们国内有李卫国老师负责的DMD关爱协会。第二，是激素治疗，需要对家长进行解释，早期应用。第三呢，是多学科的综合治疗，包括心脏监测，骨科骨密度，关节功能，呼吸功能，心理健康等等。这个一方面需要综合医院建设这样的综合治疗门诊，聚集多学科的专家，另外一方面又回到了费用问题，患者是否可以负担的起。 在充分认识了DMD的致病突变之后呢，制药公司们也在积极开发新治疗方案 。
首先给大家介绍的是针对片段缺失，外显子缺失的 exonskipping方案。
我们先来详细看一下exonskipping，外显子跳跃的治疗原理。正常情况下全部外显子是被依次翻译的。deletion造成某个外显子，或者几个外显子缺失。以49号50号外显子缺失为例，这两个外显子缺失之后，编码氨基酸的编码框的阅读位置被改变，这样翻译出的多肽链的氨基酸顺序和正常的顺序完全不同，翻译也提前终止，蛋白产物就没有了正常功能。这个Eteplirsen 是反义寡聚核苷酸，刚好有针对性的结合到51号外显子上，把这个外显子就屏蔽掉了，因此，直接从48号外显子就跳到52号外显子，氨基酸的阅读框恢复，蛋白质等于说变短了一些，但是还是有部分功能。等于把Duchenne的病人变成了Becker型。 Eteplirsen是Sarepta公司开发的一种注射药。研究发现大约13%的病人是由这两个外显子缺失导致的，所以这个药还是有一定的患者人群。在II期临床试验，治疗效果是很明显的，dystrophin蛋白的表达量在72%的患者中都上升了。这个药2016年已经通过了FDA的审批。 我们前边介绍无义突变，提前出现的终止密码子，dystrophin蛋白的翻译被提前终止了，这样的不成熟产物既没有功能，也更加不稳定，更容易被细胞降解掉。一个叫Ataluren的新药就是针对提前出现的终止密码子的。 这个分子是特异性识别提前出现的终止密码子，核糖体也是被屏蔽掉，所以翻译就会继续下去，直到正常的密码子出现，翻译终止。这样呢，蛋白质就能够被重新正确地表达出来。 Ataluren的临床试验是一波多折。最初没有限制患者的年龄，所以二期临床没有观察到6分钟行走实验的明显改善。经过几年的反复数据分析，对DMD疾病进展更深入的观察，他们重新设计的临床试验获得了成功。2016年这个药在德国已经上市，仍属于临床试验期，售价非常昂贵，一年费用是几百万欧元。但是，由于欧洲药监局认定，进入了法定医疗保险的范围，所以符合条件的患者可以使用这个药物。条件就是基因检测确定患者携带nonsense突变，并且年龄小于6岁。优点是-口服给药。 这就是我们今天的内容。在疾病的机制环节，我们了解了DMD是X染色体上的基因，dystrophin蛋白位于肌细胞膜内侧，发挥锚绳类似的固定作用。也了解了Duchenne型，Becker型肌营养不良的不同，以及女性携带者。在诊断环节，分别介绍了肌活检和基因诊断的方法。治疗部分，外显子跳跃的药物是针对片段缺失的，Ataluren是针对无义突变的。 非常谢谢大家的参与。现在我们进入提问环节。各位老师以后也可以在我知乎专栏上与我互动。 |
|
|
