西湖大学常兴课题组｜首次报道TAM碱基编辑器高效治疗DMD疾病

杜氏肌营养不良症（DMD），是由位于X染色体中编码肌营养不良蛋白（dystrophin）的基因突变引起，男性只有一个X性染色体，因此病患者大多为男性。据相关组织统计，其发病率约1/3800～1/6000活产男婴，是肌营养不良中发病率最高、病情最为严重的一型。

2014年国际United Parent Project Muscular Dystrophy（肌营养不良家长联盟）组织首次将每年的9月7日定为DMD世界知晓日。旨在让更多人知道杜氏肌营养不良，让更多人了解DMD患者的真实生活。力求广泛传播患者群体声音，提高大众知晓率，推进治疗药物的研究加速。

目前，DMD疗法有类固醇和其他小分子药物、终止密码子通读、外显子跳跃疗法和基因置换疗法等，其中基因相关疗法是治疗DMD最有希望的方法之一。目前已上市的基因相关疗法整理如下：

2021年10月26日，新芽基因首席科学顾问、西湖大学常兴教授团队在Circulation期刊（IF：29.690）上发表了题为“Therapeutic Exon Skipping via a CRISPR-guided Cytidine Deaminase Rescues Dystrophic Cardiomyopathy In Vivo”的文章。

该研究首次使用Cas9技术在dystrophin基因外显子4引入4bp缺失突变从而构建了小鼠Dmd^E4*模型，并经心脏超声、micro CT、肌力测试和组织学等多种方法检测，该模型小鼠复现了人DMD患者的扩张性心肌病和心脏纤维化等一系列表型。随后，再将AAV9-sgRNA和优化后靶向dystrophin基因外显子4的AAV9-CRISPR/Cas9-AID（eTAM）通过腹腔注射方式递送到Dmd^E4*小鼠体内，2个月后，检测到心脏组织中Dystrophin蛋白表达恢复高达90%（图1），肌酸激酶（creatine kinase，CK）水平明显降低，且肌肉张力得到明显改善，心脏纤维化明显降低（图2）。本实验所用 AAV9-eTAM和AAV9-sgRNA（1.0×10¹³vg/ml）、AAV9-eGFP均由吉满生物（Genomeditech）包装提供。

图1  AAV-eTAM/sg治疗Dmd^E4*小鼠的心脏Dystrophin蛋白表达（2-month）

图2  AAV-eTAM/sg治疗Dmd^E4*小鼠的其他表型变化（2-month）

通过生物学分析发现，Dmd^E4*小鼠治疗后心脏中的Dystrophin在mRNA水平实现了明显的外显子跳跃（图 3）。

图3 Dmd^E4*小鼠治疗实现了mRNA外显子跳跃

通过免疫荧光染色，再次证实了eTAM治疗后Dmd^E4*小鼠心脏中Dystrophin的表达，并与维持心肌细胞膜稳定的Dystrophin相关蛋白质复合物（Dystrophin associated protein complex, DAPC）中另一个重要蛋白α-Sarcoglycan共定位在心肌细胞膜周围（图 4）。

图4 Dmd^E4*治疗小鼠 α-Sarcoglycan和Dystrophin共定位在心肌膜

在Dmd^E4*小鼠接受AAV-eTAM/sgRNA治疗的12个月后，心脏组织中仍然能观察到明显的Dystrophin蛋白表达，CK水平仍低于WT小鼠的水平，纤维化程度也处于低水平（图 5），表明该治疗有效延长了肌营养不良蛋白表达并改善了生理病理表现，为后续临床上长期稳定的治疗效果提供了理论基础。

以上研究结果表明，在新生的Dmd^E4*小鼠中，通过AAV9病毒载体递送eTAM可以有效地实现外显子跳跃，恢复肌营养不良蛋白表达，并预防DMD相关的心功能障碍和肌肉营养不良。同时，第4外显子跳跃后的大量表型回复表明，N端截断的Dystrophin蛋白具有完整的功能，因此，TAM介导的外显子跳跃策略可以扩展到更广泛的DMD患者治疗中应用。

本实验所用 AAV9-eTAM和AAV9-sgRNA（1.0×10¹³vg/ml）、AAV9-eGFP均由吉满生物（Genomeditech）提供。

吉满生物十周年，十年专注病毒包装，用品质服务基础科研，AAV病毒包装限时5折优惠；更多现货质粒，现货慢病毒欢迎查询。