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责编丨迦溆 杜氏肌肉营养不良症。图片引自：https://mdbyjr. 真核细胞中， RNA剪接是基因的表达的重要环节。据估计，超过75％的人类基因具有一种以上的mRNA剪接方式 （可变剪接），其中大部分可以翻译为功能性蛋白质。但相对于基因功能而言，对于可变剪接的生理功能，认识还非常有限，原因主要在于调控内源RNA剪接的实验手段非常有限。 RNA剪接的异常也是许多疾病的直接诱因，估计35~50％的人类疾病由基因剪接异常造成。针对这些疾病，现在主要通过反义寡聚核苷酸（ASO）修复RNA剪切。但这一疗法还存在很多问题，例如，因为ASO作用于RNA，其作用是瞬时的，需要持续给药，其临床应用价格昂贵（~20万美元／年）；更重要的是，一些ASO疗法的效果十分有限, 疗效仍然需要确认。因此，无论是从学术研究或是临床应用的角度，都亟需开发出调控RNA剪接的基因编辑新方法。 中科院上海营养与健康研究院常兴课题组过去开发TAM (Targeted AID-induced mutagenesis), 也就是融合核酸酶活性缺陷的Cas9蛋白和胞嘧啶脱氨酶AID，并且发现它具有两个特点。首先，可以在sgRNA靶向的DNA上，将C/G碱基随机向其它碱基突变，可以用于分析肿瘤耐药性突变及诱导蛋白体外进化等；其次，在偶联UNG抑制剂UGI后，可以在将sgRNA靶向区域中一个小窗口内（5-6个碱基）的C高效向T突变 (Nature Methods, 2016)。 日前，常兴课题组在Molecular Cell杂志上发表了题为Genetic Modulation of RNA Splicing with a CRISPR-Guided Cytidine Deaminase的论文，利用TAM成功的实现了针对RNA剪接的“loss of function”和”gain of function” 调控，并探索了利用TAM修复杜氏肌营养不良症（DMD）的可行性，为治疗杜氏肌肉营养不良症提供新策略。 在这一新研究中，作者首先注意到，98%以上的内含子有保守的GU（内含子开始）和AG（内含子末尾）序列，推测如果可以高效精确的将G突变成A, 可以特异性阻断外显子识别，调控内源性mRNA的剪切。通过这一策略，利用TAM诱导剪接位点DNA上G>A突变，就可以诱导可变外显子(alternative exon)及组成性外显子(constitutive exon)的跳读 (Exon skipping)；改变可变剪接位点的选择（Alternative splice site）;调节互斥外显子的选择 (mutually exclusive exons)；诱导小的内含子的包含 (intron retention)。此外，如果通过TAM将３’剪接位点上游polypyrimidine track中包含的C向T突变，可以促进下游外显子的包含。 进一步结合高通量测序证明，这一策略具有永久性、高效率、高精确度和结果可预测等优点，并且不改变RNA表达水平及蛋白编码，从而可以在不分离细胞单克隆的情况下，分析可变剪接在细胞发育中的功能 (如PKM1/2在肌肉细胞分化中的功能)。对比其它可能的基因编辑方法，例如Cas9诱导的非同源重组 (NHEJ)及同源重组 (HDR),前者效率高，但不精确，只有一小部分编辑后的序列影响剪接位点；后者虽然精确，但效率低。因此，利用TAM编辑剪接位点，有机结合了高效率和高精确度，具有独特的优势。 最后，作者探索了利用TAM修复杜氏肌营养不良症（DMD，Duchenne muscular dystrophy ）的可行性。DMD是一种致命的遗传疾病（发病率男性中１/4000）。其发病原因在于，遗传突变造成Dystrophin蛋白的完全缺失，引发肌肉萎缩和瘫痪，最终造成心脏或肺功能的衰竭。如果通过外显子跳读，能产生内部截短的Dystrophin蛋白，可以达到对DMD的治疗效果。因此作者构建了DMD病人来源的诱导型多能干细胞, 此病人因为外显子删除造成Dystrophin蛋白的完全缺失。通过在剪接位点诱导G>A的突变，作者实现了目标外显子的完全跳读，在所有表达TAM的细胞中恢复了Dystrophin的蛋白表达，修复了心肌细胞的缺陷。 因此，利用TAM基因编辑，靶向DNA上的RNA剪接顺式元件，可以高效调控RNA剪接，用于研究RNA可变剪接的功能，以及用于人类遗传疾病的治疗。这一应用规避了TAM及类似碱基编辑系统(例如BE3)不够精确（会诱导bystander突变）的缺陷。 常兴课题组关注淋巴细胞发育过程中的转录后调控机制 (PNAS 2014, JBC, 2016, Immunity 2018), （Immunity丨常兴组发现铁代谢参与自身免疫性疾病发生新机制）并基于淋巴细胞分化的独特的分子机制，开发基因编辑工具 (Nature Methods, 2016；Molecular Cell, 2018),（常兴课题组《Nature Methods》报道DNA碱基编辑的新方法） 探索调控免疫细胞分化的分子机制, 为疾病治疗提供新靶点和新策略。现因科研需要，长期招聘优秀研究人员，包括研究助理、博士后和助理研究员等岗位，提供非常有竞争力的岗位待遇，有免疫学、分子生物学和生物信息学经验的优先考虑。有兴趣者可将简历发至：changxing@gmail.com. 参考文献： 1、Ma, Y., Zhang, J., Yin, W., Zhang, Z., Song, Y., & Chang, X. (2016). Targeted AID-mediated mutagenesis (TAM) enables efficient genomic diversification in mammalian cells. Nature methods, 13(12), 1029.
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