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作者：叶子 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 定量实时聚合酶链反应（qPCR）广泛用于特异性核酸的检测，RNA转录物丰度的测量和高通量实验结果的验证。qPCR通常在标准的96孔板上进行，现在实验室里的qPCR就像移液器和烧杯那样常见。 qPCR的基本步骤 在引物设计和功能分析方面，NCBI里的数据已经很多了。但这些数据只是理论上的，在具体实验操作中还要经过各种复杂的计算和实验。在以前的qPCR中，为了使测定正常进行，通常需要进行大量耗时的反复试验。 而现在，这些步骤都可以通过数据预实验来完成。更方便的是，已经有人把qPCR实验中所用到的各种工具都整合到了一个工具箱里。比如，Biosearch (http://www./oligo-toolbox) 这个网站里，就有一个成套的qPCR工具箱Oligo Toolbox，其中包含的工具能做很多实验计算工作。 Oligo Toolbox中有什么： OligoSpec™ Calculator可以确定引物或探针的特定物理性质，比如可能拥有的5'，3'或内部修饰，甚至还有荧光团、黑洞淬灭基团标记、生物素标签或修饰碱基。如果科研人员知道序列但是不知道分子量（MW），这个计算器也能派上用场，它还能把单位从“克”换算成“摩尔”。此外，该工具还提供了260 nm处寡聚物的消光系数，可与浓度计算器一起定量浓度。 这个qPCR反应估计器可以用于计算小瓶引物或探针实际上会持续多长时间。当然……是理论上，也可以来预估引物的数量。输入一些关于反应条件的基本信息，以找出寡核苷酸可能执行的反应次数。不过一些液体会因为移液而丢失，所以实际的反应次数会少于预估值。 这个有用的小工具能用来计算水或TE缓冲液的确切体积来重悬浮新加入的寡核苷酸。一些寡核苷酸厂家提供的说明书里只会教你怎么在干粉引物里加稀释剂来配100 μM的浓度。但缺点也很明显，限制太大了，如果要准备不同浓度引物，那就需要这个计算器来帮你。由于多次冻融循环会促进寡聚体降解，因此可以考虑将您的寡核苷酸分装成一系列工作浓度的等分试样。 类似上面的工具，也是一个非常简单明了的计算器。对于数学苦手来说，qPCR中的那些多任务计算实在是有心无力，有了这个后日子就好过多了。只要输入寡核苷酸的浓度、所需的最终浓度和体积和ta-da，它就能算出所需稀释剂的体积。稀释计算器还有一个有用的功能是贴心的提供了不同的单位，再也不用担心单位从皮摩尔转换到微摩尔的时候点错小数点了。 引物浓度很重要，但对于一管子未知的引物，要计算浓度可不这么简单。这个工具能在输入260nm的光密度（在实验室用分光光度计测量）或OligoSpec™ Calculator算出的消光系数，就能算出引物浓度，这是基于每个修改和基础综合值的估计。 当然消光系数260（ε260）用公式也能求，就是比较烦。ε260 = [(所有碱基的ε260之和) + (所有修饰的ε260)] x 0.9，所有的ε260值都以M-1·cm-1为单位。其中，dA (ε260=15,200)，dC(ε260=7,050)，dG(ε260=12,010)，T(ε260=8400)。 这个工具可以说是Oligo Toolbox里最大的特色。这对于设计多重qPCR实验特别有用，其需要用特定荧光团（染料）标记的多个探针来检测多个qPCR产物。基本上，不同荧光团不能在相同的波长下发射激发。 该光谱叠加工具显示每种可用荧光团和淬灭剂的吸收和发射光谱，允许用户识别任何重叠。该工具还考虑了染料与正在使用的qPCR系统（涵盖大多数制造商）的兼容性，因此可以为仪器找到最佳的荧光团和淬灭剂组。 除了工具箱之外，在这个网站上，还能找到其他qPCR设计软件和一系列不断更新的资源，包括参考论文以及所有与qPCR相关的视频和链接，安利一个。 |
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