细胞增殖检测实验的意义 细胞增殖是指细胞在周期调控的因子下,通过DNA复制等反应,完成细胞分裂的过程。增殖检测一般是分析分裂中的细胞数量的变化,进而反应细胞的生长状态及活性,目前广泛应用于肿瘤生物学,分子生物学,药代动力学等领域。 肿瘤细胞增殖和转化过程 细胞增殖检测实验的分类 细胞增殖检测实验根据实验方案和目的不同分为以下几种: 1. 细胞代谢活性检测 通过检测活细胞相关的物质的含量(如蛋白质、酶)等间接地测定待活细胞的数量来评价细胞的增殖能力。
2. 细胞DNA合成检测 通过测定细胞的DNA合成含量来评价细胞的增殖能力。
3. ATP浓度检测 利用荧光素酶Luciferase反应细胞ATP的含量,进而反应细胞活性。
4. 细胞增殖相关抗原检测 通过检测增殖细胞特异性地表达某些特定蛋白,如Ki-67,PCNA等常作为人体细胞增殖的标志。
5. 染料排斥法 活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力,而死细胞由于膜完整性的破坏,可被着色。适合少量细胞的统计,广泛用于绘制细胞生长曲线等。 以上方法我们一般是根据你的实验目的,细胞类型来决定最终的选择。
本期我们先为大家介绍了一下,第一大类:基于细胞代谢活性的检测:包括酶活如MTT、MTS、CCK8等;蛋白含量的SRB实验。又可统称为比色法,主要基于颜色的变化来反应细胞数量,十分适合高通量药物筛选,进而计算药物的IC50。
第一类:MTT、MTS、CCK8等 这一类的实验原理基本类似,细胞线粒体的脱氢酶可将MTT、MTS、CCK8等试剂还原为有色产物,可在酶标仪上于不同波长(490nm、490nm、450nm)处检测OD值,在一定范围内,吸光度值与活细胞数目成正比,进而反应细胞数量。 MTT是最早出现的检测方式,于1983年由Mosmann建立的方法,MTT为四唑盐,但是存在一定的缺陷,特别是还原产物不溶水,且对细胞有较大毒性,因此限制了其使用,目前基于MTT开发的MTS、CCK8等,应用更加广泛。
MTT对细胞的毒性: A图为刚加入MTT(0.5mg/ml)NIH-3T3细胞形态,B图为加入MTT后4h,细胞形态发生了明显改变[1]。 如下为MTS的原理:MTS被乳酸脱氢酶还原为黄色的Formazan 1. MTS的操作步骤:
注意:避光操作。为了保证实验结果有良好的线性,MTS实验中吸光度值应保持在0.75-1.25之间较好;肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。 优点:
2. CCK8法的操作步骤:
优点:
缺点:与MTT相比,CCK-8和MTS的价格贵。 注意:避光操作。
第二类:SRB比色法 SRB磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B),一种粉红色阴离子染料,在酸性条件下可特异性地与细胞内碱性氨基酸结合;在540 nm波长下产生吸收峰,在一定范围内,吸光度值与活细胞数目成正比。 实验步骤:
注意:SRB实验结果中OD值在0.8-1.2之间时线性较好;肿瘤细胞一般要根据其生长速度及本身代谢情况进行铺板。 优点:不存在孵育时间限制,即细胞固定后以放置较长时间;与MTS,CCK8相比,检测时间可以自己掌握,不受限制,更适合大规模试验。 缺点:操作步骤繁琐,不适合悬浮细胞。 如下图,图A表示肺癌细胞系H441细胞数量与SRB染料对应的吸光度值成线性关系,B图显示SRB方法来测试miRNA对两株肺癌细胞细胞系的增殖影响[2]。 常见问题汇总 MTS、CCK8及SRB法等方法,如何确定选择哪个? 大家可根据实验要求和预算进行选择,价格方面,CCK8和MTS大于SRB,但是SRB操作较繁琐,但个人觉得SRB线性更好,但不适用于悬浮细胞。 OD不在线性范围内,怎么办?误差大吗? 如MTS要求0.8,(通常来说,比色法测定细胞增殖试剂盒中都会注明最佳反应时间,通常MTS/CCK8反应最佳时间为1h-4h,我们实验初期固定孵育时间如1h,通过比较不同细胞量的OD值来确定实验细胞铺板量,根据具体情况进行调整。 对细胞密度有要求吗? 不同类型的细胞,代谢活性不同,影响细胞代谢的因素也会影响细胞数和吸光值的关系。细胞在高细胞密度时会产生接触抑制,进而代谢活性降低,导致细胞数和吸光度值的非线性关系。对大多数肿瘤细胞,杂瘤细胞和纤维母细胞系,推荐5000cells/孔作为增殖研究的起始细胞数,虽然少于1000个细胞通常也可被检测。血淋巴细胞例外,一般需要25,000–250,000细胞/孔才能获得足够的吸光值。可以参考下图的实验来确定细胞数。 本期我们就为大家介绍到这这里了,主要讲述了比色法的几种常见实验,我们要根据自己实验目的和细胞类型来选择最合适自己的方法。下一期我们继续为大家介绍剩余的几种检测方法。
参考文献 1. Riss T L, Moravec R A, Niles A L, et al. Cell viability assays[J]. 2016. 2. Kasinski A L, Kelnar K, Stahlhut C, et al. A combinatorial microRNA therapeutics approach to suppressing non-small cell lung cancer[J]. Oncogene, 2015, 34(27): 3547-3555 |
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