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相信养过细胞的小伙伴们一定离不开做增殖曲线，然而每个人恐怕都遇到过做MTT重复性不好，换成CCK8又不舍得的心理纠结过程（土豪实验室请止步，下文不适合阅读），事实上除了这两种方法检测增殖外，你还有另外一种重复性好又经济的方法。虽然步骤稍微繁琐，但其在增殖检测中具有独特的存在意义。 这一方法叫做SRB增殖检测。SRB就是磺酰罗丹明B，确切的说是一种染料。这种方法首次详细报道是在2006年，发表于Nature Protocol上1。尽管这个方法似乎有些小众，但事实上确实经济划算效果好，在多次实践掌握方法后，做出来的增殖曲线可以说是误差线小到看不见，而且最为关键的一点是，重复性特别好！唯一的缺点就是步骤有些繁琐，但是其优良的重复性以及结果的稳定性，一定会让你觉得是非常值得的。 除了重复性好这一巨大优点，SRB在增殖检测中具有独特的意义。这种意义主要体现于在做代谢相关课题的时候。 比如这篇发表于Nature Cell Biology的文章就大量用了SRB的方法来检测增殖2。这篇文章主要是关于谷氨酰胺代谢，在这篇文章中大量运用SRB的原因主要在于其检测肿瘤增殖的机制。这儿不得不提的是各个增殖检测方法的检测原理，MTT是通过活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶将外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒，CCK8是通过细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物，另外一种更昂贵的检测细胞增殖的方法cell titer则是通过检测ATP反映细胞活力。这些方法均与细胞代谢相关，当你不明确你做的基因或者药物是否会影响这些环节的时候，SRB应该相对来说是比较理想的方法。SRB是一种能与生物大分子的碱性氨基酸结合的水溶性蛋白染料，其结合于细胞中量的多少可以反映总蛋白量进而反映细胞数的多少。如果你的研究是关于肿瘤代谢的，那么SRB将是最为理想的检测方法。 下面简单介绍一下SRB的实验方法： 1）首先是利用10%三氯乙酸（有腐蚀性，注意点就行，没那么恐怖）进行固定，在4度中过夜（其实可以放很久，经常攒了好多板了一起做，固定时间不一样对结果没有什么影响） 2）之后用蒸馏水洗干净（固定后细胞还是很稳定的，基本不会被冲掉，不用太温柔，我一般都是甩掉，这一步其实自来水也没啥影响，不过还是推荐用纯水） 3）后晾干过夜（这一步可以在烘箱中37度烘干三十分钟，不着急就直接过夜就行了） 4）第二天开始染色，用0.4%浓度的SRB染色20分钟就足够了，然后用1%的乙酸洗干净（一定要洗的没有残留染料） 5）再次过夜晾干（还是可以烘干） 6）之后用10mM Trisbase 溶解后用510nm或570nm检测吸光度（颜色很深的时候推荐用510nm，其他时候建议570nm） 到这儿就结束了，虽然有点麻烦，但是确实重复性非常好，结果也非常稳定，当你需要有大量的板要测又苦于实验经费的时候，强烈建议使用这一方法，本人在做的时候往往一次会做50块板以上，习惯了其实很简单。再提醒大家一下，买试剂的时候是用磺酰罗丹明B，而不是罗丹明B，这两个东西不一样。 参考文献 1. Vichai V, Kirtikara K. Sulforhodamine B colorimetric assay for cytotoxicity screening[J]. Nature protocols, 2006, 1(3): 1112-1116. 2. Lien E C, Lyssiotis C A, Juvekar A, et al. Glutathione biosynthesis is a metabolic vulnerability in PI (3) K/Akt-driven breast cancer[J]. Nature cell biology, 2016, 18(5): 572-578. 李莫愁博士：感谢Sean的投稿，说实话，这种方法确实还挺麻烦的，但是如果实验结果好的话，这点耗时其实还是能忍受的。好了，祝大家实验愉快，今天，呃，不是，是差不多今年就要策到这里了，接下去大家都没心思做实验了吧。 |
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