|
“我们不会生病吧？是吧？”我的室友布雷特问我。他哭丧着脸看着我跪下来把一盘大肠杆菌塞进冰箱里，这是从我在网上买的 CRISPR-Cas9 DIY 试剂盒中拿出来的，现在这盘大肠杆菌正和我们的鸡蛋、草莓酱、瓶装啤酒和一块奶酪待在一起。 “放心吧，没事的。标签上写着’非病原’”我回答道，试图让自己显得很有说服力。但说实话，我也不知道我在做什么。我把所有的食物都推到边上，留下一个两英寸的边沿围绕着这盘活细菌，我们的食物和微生物正紧紧靠在一起。几英寸可能阻止不了细菌感染食物，但我已经说了，它不会伤害到我们。 CRISPR-Cas9（简称CRISPR）为科学家们提供了一种强有力的方法来精确地改造DNA，包括微生物的、植物的、老鼠、狗甚至人类细胞。这项技术可以帮助研究人员培育抗旱作物，开发更好的药物，治愈遗传疾病，根除传染性疾病等等。如果你去问任何生物学家，他们几乎都会告诉你 CRISPR 是革命性的生物工具。它既便宜又有效，而且在很多情况下，它比老式的基因改造方法要好得多。生物学家也会告诉你 CRISPR 很容易使用。但是“容易使用”是什么意思呢? 我不是一个喜欢 DIY 的科学家，更算不上一个专业的科学家。我肯定不会在周末跑到实验室，用自己口腔颊侧的细胞提取 DNA 或者拼接酵母 DNA 。但我想知道： CRISPR 有多简单？难道像我这样的业余爱好者也能对科学做出有意义的贡献吗？而且，这项新技术是否使基因编辑变得非常容易，以至于我们需要担心科学家会不会在他们的地下室里 DIY 大批传染性病毒？如果你用 Google 搜索“DIY CRISPR”，会弹出诸如”用 DIY Gene Hacking Kit 制造突变细菌会发生什么”这样的问题吗？ 我试图找出这些问题的答案，就从我在旧金山公寓厨房里的这盘细菌开始。 CRISPR 指的是“成簇的规律间隔的短回文重复序列”。CRISPR 系统由两个部分组成，一个是叫做 Cas9 的蛋白质，还有一个引导 RNA (guide RNA, gRNA)，这是一串有一定遗传密码的核酸分子。把它们放在一起，就创造了一个工具，帮助调整生物体的基因组。为了做到这一点，CRISPR 会在生物体 DNA 中搜索特定的序列，具体地说，这段序列能够与 gRNA 的序列互补。“Cas9 打开 DNA，将它的双螺旋结构分开形成一个小窗口，允许 gRNA 与其中一条链配对，”犹他大学生物化学系教授德纳· 卡罗尔（Dana Carroll）解释道，“如果配对得好，Cas9 就会对目标 DNA 上的这个区域进行切割。但如果配对不成功，Cas9 和这个 gRNA 就会脱落下来并在别的地方重新配对。直到找到正确的序列，Cas9 才会对 DNA 进行点对点的剪切。 在这之后，如果你没有对细胞进行干扰，它通常会修复 CRISPR 的切割，但修复过程偶尔也会出错，破坏基因甚至基因组的其他成分。由于 CRISPR 在细胞修复后不断地返回并切割 DNA，因此基因最终被破坏，或者以技术术语来说，被敲除。而且，如果你添加新的 DNA 进去，细胞可以以此为模板进行修复。这意味着只要知道目标区域的基因序列，你可以在你想要的基因组的任何区域插入 DNA。 CRISPR-Cas9 切割 DNA的原理 图片来源：AXS生物医学动画工作室 科学家们最初在古细菌和细菌中发现了这个复杂的系统，能起到切割入侵病毒的防御作用。但几年前，研究人员发现了新的方法，能够将 CRISPR 重新定位到几乎所有他们想要的生物上。现在，改造基因比以往任何时候都容易。 在我自己的实验中，我所需要的东西都放在一个小硬纸盒里，里面有各种各样的瓶子、试管、培养皿、粉末和液体(以及大肠杆菌)。我从众筹网站 Indiegogo 上订购了这个试剂盒，价值 130 美元。 这是旧金山湾区生物黑客约西亚·赞内尔（Josiah Zayner）发起的活动的一部分。赞内尔拥有分子生物物理学博士学位，并曾在 NASA 做了两年的研究员。他在自己的公寓里发起了众筹活动，最后筹集了超过 7 万美元，卖掉了 250 个 CRISPR DIY试剂盒——其中一个现在放在我的厨房桌子上。赞内尔现在主要通过他的公司网站 Odin 出售这些东西，他已经卖出了上千套这类试剂盒。 作者的 CRISPR DIY 试剂盒 CRISPR 试剂盒背后的想法很简单：改造大肠杆菌，让它能抵抗链霉素——这种抗生素能杀死大部分细菌。在材料和说明书的指导下，我将把 CRISPR 引入细菌细胞，并利用它改写一部分 DNA，创造出基因改造的细菌——这些细菌能能在链霉素上茁壮成长。最终，CRISPR 将追踪整个大肠杆菌基因组共 460 万个碱基对，只改变其中一个碱基对。它将化合物腺嘌呤换成胞嘧啶，相当于基因字母表中把 A 换成 C 。由于这种微小的密码变化，我的细菌细胞将会表达赖氨酸（lysine）而不是苏氨酸（threonine）。如果我的基因编辑成功，这将阻止链霉素干扰大肠杆菌的生长。 五月的一个周一下午，我戴上乳胶手套，在餐桌上摊开报纸。我从冰箱里拿了三个小塑料试管，从我的 DIY 试剂盒中拿出一个移液器（一个实验室里用的手持式仪器，用于吸取液体），然后开始在装有大肠杆菌的试管中加入 CRISPR 成分。 作者在厨房准备 CRISPR 实验 我把 Cas9 蛋白和 gRNA 加进了我的细菌里，这都是装在小的塑料管里的液体成分。然后我用移液器从装着 DNA 的小试管里吸取了 10 微升 DNA。可是 DNA 堵在了我的移液器里——我眯起眼睛看着那一滴清澈的液体，意识到它已经凝固了。我不知道为什么，希望这不是问题。这会影响我的实验吗？我完全不知道，所以我就等着 DNA 融化再把它打进细菌的管子里。 几个步骤之后，我把我的 CRISPR 细菌铺在三个塑料培养皿上，放在了我的洗衣间里。说明书上说要等待 24-48 小时，然后查看板子上细菌生长形成的小白点。如果我能看到它们，那么就说明 CRISPR 成功改造了细菌的在链霉素抗性基因。如果不是……那好吧，失败也是科学发展过程的一部分。 做完了这项实验，我可以负责任地说，CRISPR 实验很简单。我基本上只是测量、吸取和搅拌了一堆材料，偶尔冷却或加热它们。但对于我想象中 CRISPR 赋予的所有神奇力量，就我进行的实验而言，我实际上并没有发言权。一切都是预先确定好的，就像一部烹饪书中的步骤一样：“加入 100 微升转化混合物到一个新的离心管”，“在冰箱里孵育 30 分钟”等等。到最后，我什么想法都没有。当然，我本可以设计一个独特的 CRISPR 实验，但它需要花费更多的时间，更多的材料，更多的钱，以及比我现在拥有的还要多的知识。 48 小时后我查看了我的细菌。我掀开第一个培养皿的盖子，没有白色的点。然后第二个，还是什么也没有。我的心失望地沉了下去。然后我轻轻掀起第三盘的盖子，看见了一些东西。盘子里有两个淡奶白色的圆点。CRISPR 成功了吗？也许吧。但是为什么一个盘子有斑点，另外两个却没有呢？我在每个培养皿上都进行了同样的操作，也许我的大脑和眼睛在捉弄我，或者第三个盘子已经被我污染了。要是我能把这个长着迷之事物的培养皿拿给一个知道怎么解释它们的人看，那多好啊，比如一个科学家。但很不幸，我的厨房里没有这样的人。 几周后，我驱车 40 英里去往旧金山南部，见一个名叫约翰·索萨（Johan Sosa）的业余 DIY 科学家，他比我更了解 CRISPR 。我们在圣克拉拉的 BioCurious 见面，这是森尼维尔（Sunnyvale）的一个社区实验室，他大部分周末和晚上都在那里工作。BioCurious 是一个有科学设备配套的合作空间，由“科学家、技术专家、企业家和业余爱好者共同分享，他们认为生物学的创新应该是可接受的、负担得起的、对每个人开放的”（摘抄自其网站）。该实验室由捐款和会员组织资助，而索萨就是它的几十个成员之一。 索萨身高 1 米 95，超过了大多数人。他开玩笑说，“我可能是个头最高的 DIY 生物学家。”他笑得很放松，这抵消了他的身高给我带来的压力，使他看起来温和又悠闲。 索萨今年 40 岁了，他的深色头发中掺杂着银色的发丝。他来自斯里兰卡，15 岁时来到美国学习计算机科学，他曾在美国银行（Bank of America）和 IBM 担任计算机安全专家和软件工程师。他现在的全职工作是计算机安全，但是大部分的空闲时间都在 BioCurious。他笑着说，“你可以说我没有生活，但这是我最大的爱好。”他阅读科学论文、观看 YouTube 视频、参加讲座，以及在自己的课题中反复试验，并向 BioCurious 的好友们讨教，不断学习科学前沿进展，包括理论和实验技术。 索萨是 BioCurious 中使用 CRISPR 的几个业余 DIY 科学家之一。2012 年，他第一次从加州大学伯克利分校的生物化学家、CRISPR 技术的先驱之一詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）发表在《科学》杂志上的文章中读到这项技术。他回忆说：“最开始我并不认为这是一件大事，因为我知道已经有其他方法来改造 DNA 了，但我确实认为，这是我能做的事。”于是在 2013 年，他开始使用 CRISPR 做实验。 在一个闷热的下午，我跟着索萨穿行在 BioCurious 里。我们漫步穿过一个大厅，走进一个没有窗户的大房间。里面有一个大柜子，塞满了瓶装的液体、乳胶手套、一个巨大的生物通风橱、微波炉和冰箱。显微镜、磅秤、离心机和其他用旧了的的科学仪器散落在实验室的桌子上。房间里满是嗡嗡作响的机器，附近的孵育箱里有试管在静静地摇晃着。约翰在房间里走来走去，寻找温度计。他告诉我：“ DIY 实验室常发生的一件事是，你把某样东西放在某个地方，但它总会在另一个地方出现。” 业余 DIY 科学家索萨正在操作 CRISPR 我紧跟着索萨，这样我就能了解更多 CRISPR 对科学家的意义，我也希望能在他的帮助下做一个更成功的实验。我们定了一个非常基本的目标：使用强大的编辑工具来切割他已经从酵母细胞中提取好的 DNA 。这个任务比我之前在厨房做的更简单，因为你不需要将 CRISPR 转入细胞中再切割 DNA 。专业科学家可能会把这种方法作为中间步骤，例如他们需要将 DNA 剪切并重新连接到一起，把新的基因用于研究另一个项目。杜克大学生物医学工程教授格查尔斯·格斯巴赫（Charles Gersbach）解释道，“这是每个人每天都在做的一种实验。”他指出，传统方法是用一种叫做限制性内切酶的蛋白质来完成这项工作。 索萨和我戴上乳胶手套，小心翼翼地用移液器吸取液体到管子里，我们首先合成了 DNA 双链的目标区域，作为模板合成出 gRNA，然后破坏 DNA 并从混合物分离出 gRNA 。之后，我们把 gRNA 加入一个新管子里，连同其它帮助 CRISPR 发挥作用的试剂，包括蛋白质缓冲液、牛血清白蛋白（一种从牛血清中分离出来的蛋白质）和水。索萨用移液器去吸他提取的酵母 DNA，突然，塑料吸头脱落掉进了装着 DNA 的管子里。他告诉我，这种吸头是别人捐赠的，但是和移液器的尺寸不匹配。他微笑着说，“我猜你很有经验”，一边把塑料吸头安回到移液器上。然后他拿起了 Cas9 蛋白递给了我，告诉我说，“这是世界闻名的 Cas9 ”，我把它加到了我们的试管里。 直到 CRISPR 出现，这些业余的 DIY 科学家们终于有了简单、廉价而可靠的方法来精确编辑 DNA。他们中的许多人负担不起专业科学家在当时用于基因编辑的昂贵却不完美的工具。索萨解释道，“在 CRISPR 之前，有 TALENS （能产生类似于转录激活效应的核酸酶）和锌指核酸酶，这些老技术不是那么精确可靠”，“它们对我们这种 DIY 科学家来说超出了预算，时间也不允许”。索萨说：“如果一个人使用其他技术做基因工程实验，可能需要花费数千美元，但对于 CRISPR 来说，它更容易负担得起，尤其是如果你想尝试不止一次的实验。” “用 TALENS，你试过一次，失败了，那可能就没有条件再做一次，但是用 CRISPR，你可以尝试多次，这本身就是一件大事。” 这意味着，CRISPR 提供了一种通向科学的全新方法。到目前为止，索萨和他的实验室伙伴已经用多种方法尝试了 CRISPR 这项技术：切割酵母基因组，切割大肠杆菌细胞中的 DNA，并试图通过压缩或连接上别的分子来修饰 CRISPR 系统。索萨对他的 CRISPR 课题有一个明确的研究目的：“我想了解一个细胞真正的功能，以及在它身上发生的所有细微的事情。当某些东西出了问题（比如在疾病中），如何修复它，或者让它按我说的做。” 几个小时后，索萨和我检查了 CRISPR 是否切断了我们的酵母菌 DNA 。我们把我们的 DNA - CRISPR 混合物染成蓝色，通过凝胶电泳，将较大的 DNA 片段与较小的 DNA 片段分开。在凝胶微小的通道里，电荷从一端的负电极跑向另一端的正电极，将切开的 DNA 链拉向带正电的那一端。如果我们的实验成功了，我们就会看到两条带，因为本该完整的 DNA 链被 CRISPR 切开了，而凝胶上另一个通道中应该只有一条带，那是分子量更大的没被切开的 DNA 链（对照组）。 索萨把凝胶放进暗室，我们关上灯，在紫外光下查看它。当我检查凝胶上的印记时，我屏住了呼吸。一条浅蓝色的带在黑暗中闪烁着光芒，这是对照组，另一条带出现在我们的 CRISPR 剪切组的泳道上，但只有一条带。索萨说，“我不知道发生了什么，但是看起来不太妙，可能没有成功。” 我离开了实验室，感觉打了败仗，回到旧金山几分钟后，索萨给我发了短信。 “嘿，我弄清楚了。”他写道，“最初我们要剪切的DNA没有加进去。” “怎么会这样呢？”我回复他。 他写道：“我认为 DNA 可能降解了，或者浓度太稀。” 即使我们其它所有成分（RNA，蛋白质等等）都发挥作用了，也是白费力气，因为这都不重要，我们没有给 CRISPR 任何 DNA 来切割。我的 CRISPR 实验第二次尝试彻底失败了。 暂时放下我对 CRISPR 实验的沮丧，我想看看专业生物学家利用 CRISPR 做些什么，所以我去了加州大学伯克利分校的尼扎姆·帕特尔（Nipam Patel）的实验室。 参观完实验室之后，我坐下来，盯着显微镜，注视着一个小小的、蠕动着的海洋生物：来自夏威夷的 Parhyale hawaiensis，通常被称为沙蚤。它仅有一厘米长，很难被发现，你甚至在海滩上都不会注意到它。但在显微镜下，雌性沙蚤就像一个巨大的半透明虾，有许多有力的脚。它是这个实验室的明星，“我们正在研究这种生命个体的身体是怎么发育的，”帕特尔实验室的博士生艾琳·贾维斯（Erin Jarvis）解释道，“还有它如何在进化过程中建立身体形态。”这就是他们用 CRISPR 来做的事。 沙蚤是加州大学伯克利分校的帕特尔实验室的焦点。他的团队正在使用 CRISPR 来研究其发育基因。 他们利用 CRISPR 敲除了沙蚤体内的 Hox 基因。这种基因在所有动物体内都有表达，包括人类，它控制着身体发育。除此之外，它还决定了在身体的哪个部位发育出具有哪些功能的四肢，比如用于游泳的腿，爪子和触角等。比如，用 CRISPR 敲除某些部位的 Hox 基因，沙蚤就会在它应该长出用于跳跃的腿的地方长出向前行走的腿。 沙蚤有 9 个 Hox 基因，帕特尔的团队已经敲除了其中的 7 个。研究人员还计划将全新的基因表达在沙蚤体内，当然，这也是用 CRISPR 做的。他们已经实践过一次了，通过插入一种编码绿色荧光蛋白的基因，这使得研究人员能够将沙蚤体内表达的特定的 Hox 基因可视化。“从进化的角度来看，这让我们对不同物种之间身体发育的不同有了深入的了解，”把沙蚤和果蝇（一种研究得很透彻的模式生物）进行比较，帕特尔说，“我们相信这种进化模式帮助我们理解进化创造出的动物多样性。我们可以进一步了解这些基因在其他动物中发挥的功能，比如人类。” CRISPR 改变了帕特尔和他的同事们的研究方式。他的实验室的沙蚤研究已经进行了大约 20 年。在 CRISPR 之前，他们使用了另一种技术敲除基因，需要花费更多的钱，即便如此，它也不是很有效率。他们用另一种方法在一组沙蚤胚胎中敲除一个基因，花费了大约 900 美元。这种被称为“ RNA 干扰（RNA interference）”的技术是通过沉默基因的信使 RNA 实现的，它并没有像 CRISPR 那样从根源上解决它。问题是，有时这种方法根本不起作用。 现在，敲除一个基因仅需要花费不到 100 美元。“突然之间，有了 CRISPR，你不必纠结自己应该把所有的资源放在哪一个基因上，”贾维斯说，“你可以尝试很多不同的基因。”而且，在 CRISPR 的帮助下，他们能够成功将 75% 的沙蚤胚胎的基因切断，而使用旧技术的成功率最高为 25% 。更妙的是，他们现在有能力用 CRISPR 来同时突变几个基因，这意味着可以看到基因是如何相互作用的。如果用旧技术突变多个基因则很少奏效。（不过帕特尔指出，旧的 RNA 沉默技术在某些时候仍然非常有用）。 来自帕特尔实验室的正常和突变的沙蚤，不同颜色标记强调不同类型的肢体和身体部分。 上排：一个正常发育的沙蚤 。 中排：用 CRISPR 造成的腹部 A- Hox 基因的突变体，它的跳跃腿被转换为向前行走的腿，游泳的腿被固定腿取代。 下排：用 CRISPR 造成的腹部 B- Hox 基因的突变体，腹部的游泳腿和固定腿被胸部的跳跃腿和向前走的腿所取代。 图片来源：Erin Jarvis 和 Nipam Patel, UC Berkeley 利用 CRISPR，他们缩短了研究时间，2015 年发表在《当代生物学》（Current Biology）杂志上的一项研究中，他们在大约一年内敲除了 6 个 Hox 基因。在此之前，他们已经花了好几年的时间试图用旧方法敲除一个特定的 Hox 基因，但却无法实现。 “一切都进展得更快，”遗传学、基因组学和发育生物学教授帕特尔说。“ CRISPR-Cas9 是一个非常优雅的工具，它很容易控制。”这也使得研究更独特的生物（不是常用的果蝇和老鼠）变得更简单，比如像沙蚤或蝴蝶这样的生物。贾维斯说:“从事新发现的生物体的研究一直都很困难，CRISPR 非常棒，因为它出现之后，你就不必花上几十年的时间来开发一个模型。......只要你有你想要研究的基因序列，你就可以着手去做了。” 帕特尔的实验室并不是世界上唯一 1 个利用 CRISPR 进行生物研究的实验室，全世界的科学家们正在探索基因编辑工具的各种用途，例如消灭疟疾传播的蚊子，寻找治疗癌症的新方法，或创造抗病作物。 今年 7 月，研究人员宣布他们利用 CRISPR 成功编辑了人类胚胎基因组；这项技术使他们能在胚胎 DNA 中修复致病突变(尽管一些人现在对这项结果持怀疑态度)。就在几周后，马萨诸塞州的科学家报告说，他们已经在猪器官人体移植方面取得了重大进展。他们使用 CRISPR 将 25 种病毒从猪的基因组中失活，克服了猪器官移植过程中生物安全这个巨大障碍。 这趟 CRISPR 实验的旅行已经走到了终点，那么我学到了什么？ 首先，我发现，我的室友怀疑冰箱里的 CRISPR DIY 试剂盒会让我们生病，这是可以理解的。今年，德国当局限制了进口的 Odin DIY CRISPR 细菌试剂盒，此前巴伐利亚卫生和食品安全管理局（Bavarian Health and Food Safety Authority）测试了其中的两套，发现它们含有潜在致病菌。但欧洲疾病预防和控制中心（European Center for Disease Prevention and Control )得出的结论是不需要担心，“被试剂盒污染而感染的风险对使用者来说非常低，假如他们是健康人的话。” 赞内尔拒绝就此事发表评论，但他在 Twitter 上公开发表了回应，他批评了巴伐利亚机构使用的方法，并否认他的公司存在不当行为。目前，这些试剂盒仍然可以通过 Odin 网站在线购买。 我还有个更大的问题：不经过训练的人能真正实现科学突破吗？我问了学术研究人员他们的想法。德纳·卡罗尔认为，业余爱好者也可以做出有意义的发现。他解释说：“在专业的科学界，人们不断创造出这种技术的新用途，但是人们的想象力实在是有限的。”“在他们的车库或厨房里工作的人可能会想出一个新奇的用途，或者解决专业人士一直没有解决的问题。”卡罗尔说，与研究人员分享你的发现，通过参加他们的谈话或通过他们的网站与他们取得联系，这都是很容易的。但他指出，业余 DIY 科学家俱乐部始终受局限，因为他们很可能缺乏必要的资源。他说：“他们不太可能会一直做完一个项目直到成果转化，但他们肯定至少能开始做一些事情。” 最后，我想象了一个噩梦一样的场景：CRISPR 如此简单易行，我们是否需要担心生物黑客故意制造危险的病原体？卡罗尔和其他人认为，将 CRISPR 置于普通人手中的危险性相对较低。他说:“人们已经想象到，科学家们可以用 CRISPR 来制造一种致命的病原体。”“风险有多大?”“它不是零，但相当小。“格斯巴赫表示同意。他解释说:“现在，很难想象它是如何变得危险的，如果你想要报复社会，会有比使用这种高度复杂的基因编辑技术更简单、更方便的方法。 回到帕特尔的实验室，贾维斯在我刚刚看的显微镜下把蠕动的雌性沙蚤换成了一个小小的卵。贾维斯告诉我，她在这个胚胎里敲掉了一个叫做 abd-B 的 Hox 基因，这个胚胎将会在它应该长出游动腿的地方长出跳跃腿，在固定腿的位置长出前行腿。对我来说，它看起来就像一个不透明的球。 在我旁边，另一名研究生检查了一片棕色和金色蝴蝶的翅膀，帕特尔的实验室也在用 CRISPR 敲除蝴蝶的基因，看看它们是如何构建翅膀颜色的。贾维斯告诉我:“一个研究生曾经开玩笑说，我们可以从基因上改造翅膀来制作蒙娜丽莎的画像。”我笑了，在显微镜下瞥了一眼。我的呼吸突然打在了沙蚤的胚胎上。它开始在培养皿上疯狂地跳舞，就像被暴风雨困住的一粒沙子。 编者按：10 月，赞内尔迈出了重要的一步——他开始尝试用 CRISPR 编辑自己的基因。11月，美国食品药品监督管理局发表声明，表示赞内尔这类生物黑客向大众贩卖 CRISPR DIY 试剂盒的行为是违法的。但也有部分舆论认为，至少人们对自身基因进行改造的权利不应该被剥夺。 |
|
|
