内标法测序研究生物炭对大豆土壤细菌群落的影响

研究背景

当前大多16S rRNA基因高通量测序分析在比较样品间微生物组成的时候往往仅考虑微生物组成的相对丰度，而忽略了样品间目标微生物可能存在绝对含量的差异；而绝对丰度能为反映微生物群落结构及其动态变化提供更多有价值的信息（Zhang et al. 2017）。内标法测序通过添加土壤中不存在也不会跟土壤细菌类群有较近遗传关系的内标菌株，结合高通量测序的方法能够同时得到样品的绝对丰度和群落组成，从而进行样品间群落组成的绝对丰度比较。本文将介绍内标法测序的一个研究实例：内标法测序研究生物炭对大田大豆根际和非根际细菌群落的影响（Liu et al. 2017）。

方法原理

DNA提取前，向土壤样品添加已知浓度的内标菌株Aliivibrio fischeri (ATCC7744)；为了不影响土壤细菌群落结构，内标菌株A. fischeri 的DNA加入量控制在土壤DNA总量的0.1%左右；然后进行16S rRNA基因扩增子高通量测序，从测序结果中，通过对比内标菌株和土壤中细菌的16S rRNA基因序列的相对丰度，从而计算出土壤样本中16S rRNA基因的绝对丰度（流程见图1）。计算公式如下（Smets et al. 2016）：

Ri：高通量测序结果中，内标菌株A. fischeri的16S rRNA基因序列数目；

Rs：土壤样品中，除去内标菌株基因序列的其它菌群的序列数目；

wi：加入土壤样品中的内标菌株的gDNA的质量；

gi：一个内标菌株基因组的质量，为4.49*10^-15 g/A. fischeri基因组；

ci：内标菌株16S rRNA基因的拷贝数，每一个A. fischeri基因组中有8个16S rRNA基因拷贝；

x：待计算的土壤样品中16S rRNA基因的绝对数量。

图1 内标菌株-高通量测序法流程（Smets et al. 2016）

研究内容

结合内标菌株和16S rRNA基因高通量测序方法研究大田试验中生物炭对大豆根际和非根际土壤中细菌群落结构的影响，具体包括：（1）通过对添加内标菌株A.fischeri基因组DNA的土壤样品DNA进行高通量测序，比较不同处理下土壤细菌的相对丰度和绝对丰度的差异；（2）研究生物炭对大豆根际和非根际土壤中细菌群落丰度和多样性的影响；（3）结合环境因子和群落结构探索生物炭影响土壤细菌群落结构的机制。           

研究结果

① 通过添加内标菌株结合高通量测序方法，能够同时得到样品的绝对丰度和群落组成。图2是细菌门水平上相对丰度和绝对丰度信息的饼状图，与绝对丰度相比，相对丰度忽略了一些信息，比如生物炭的添加显著促进了根际土壤细菌总量的增长。

图2  不同处理细菌门水平相对丰度(a)和绝对丰度(b)群落结构组成

CKR：根际不加生物炭；BR：根际加生物炭；CKB：非根际不加生物炭；BB：非根际加生物炭。*表示差异显著性（p <>

② 通过PCoA分析，发现在大田试验中，生物炭施用对根际和非根际土壤中细菌群落结构都会产生影响（图3）。与非根际土壤相比，生物炭的添加显著增加根际土壤细菌绝对丰度；LEfSe结果也表明，对生物碳有响应的根际土壤细菌种类更多，可能加强了根际效应（图4）。

图3. 基于加权（a）和不加权（b）的Principal Coordinate Analysis (PCoA)分析

图4 生物炭对根际（a）和非根际（b）土壤中细菌各分类水平下的线性判别分析（LDA）

③ 通过RDA和VPA分析，表明生物炭主要通过直接作用（土壤的理化性质，如含水量和有效钾）以及间接作用（如植物根的生物量）而影响土壤中细菌群落（图5）。

图5  根际和非根际土壤中细菌群落结构结合土壤和作物指标的冗余分析（RDA）、变差分解（VPA）和Mantel检验分析

       结语

通过内标法测序研究生物炭对大田大豆根际和非根际细菌群落的影响，结果表明生物炭促进了根际细菌的数量和多样性的增长，加强了根际效应。同时说明在比较样品间细菌组成的时候有必要考虑样品间细菌数量的差异，内标菌株-高通量测序法能够同时得到样品的绝对丰度和群落组成，可以为土壤中细菌群落多样性研究提供一种更准确的方法。但目前为止，该方法还仅限于对土壤细菌的绝对定量，对于古菌、真菌等微生物及其他环境样品的绝对定量还有待于进一步开发。

参考文献

Zhang, Z. J., Qu, Y. Y., Li, S. Z., Feng,K., Wang, S., Cai, W. W., … Deng, Y. (2017). Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa. Scientific Reports, 7, 4837.

Smets, W., Leff, J. W., Bradford, M.A., McCulley, R. L., Lebeer, S., & Fierer, N. (2016). Amethod for simultaneous measurement of soil bacterial abundances and community composition via 16S rRNA gene sequencing. Soil Biology & Biochemistry, 96, 145–151.

Liu X.R., Li J., Yu L., Pan H., Liu H.Y.,Liu Y.M., Di H.J., Li Y., Xu J.M. (2017) Simultaneous measurement of bacterial abundance and composition in response to biochar in soybean field soil using 16S rRNA gene sequencing. Land Degradation Development. 1-11. https:///10.1002/ldr.2838.