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作者：麦子 转载请注明：解螺旋·临床医生科研成长平台 之前咱们说到从TCGA数据库中拿到了具有明确的表型、值得进一步研究的候选基因，那么接下来就要发文章、准备基金申请的工作了。 然而要发文章又该做什么研究呢？多少钱？有哪些坑？再要申请基金该如何立题？这是今天要解决的事。 表型确认后怎么设计SCI的研究方案？ 接下来，如果表型已经幸运地确认了，又要怎么做才能让它从一颗小种子长成参天大树呢？ 关于这一类功能基因研究的paper框架设计其实我们在很多场景中都讲到，36策课程中有比较深入的讲解，比如整个基础研究是有一个5恒量3变量的系统，这很难在短时间内解析，所以现在只简单谈一谈套路，其他问题大家还是去36策课中找答案吧。 功能基因的表型研究也遵循一定套路，在既定的癌症研究方向下，会有固定的细胞模型、动物模型，有检测指标和检测方法。初学者可以在很多文献中总结，仔细读大约5-10篇文献，大概知道这研究的套路是什么。 说到具体靶基因的研究，在第9策讲了功能基因研究的5步法研究思路，这里不重复了。在第13策也介绍了做机制时在靶分子的基础上，下游再加一个变量，去找信号通路，做间接作用机制比较快捷的3种方法。 这类文章的数据大概可分成4个部分：第1部分是临床相关性研究，如果从TCGA切入，那临床相关性研究的数据已经有了一部分，可再做些自己样本的验证；第2部分是细胞表型实验，如前所述；第3部分是分子机制研究；第4部分是动物模型验证。 根据预期要发的文章的档次，这些数据结构又有些许变化。 如果只要是SCI就行，3分以下就可以，那么有了临床相关性研究的证据之后，再把前面验证表型时做的那些实验拼一拼也基本足够。临床相关性的证据稍微做的好一点，临床标本的检测和统计分析方法都比较简单。 接着再在1~2株细胞中把细胞表型确认一下，通过细胞表型来解释为什么临床上这个指标高表达或者低表达与癌症的发生发展有关系，这已经构成了一个paper的完整的故事。 不过现在3分以下的Paper已经越来越难用了，临床上普遍的科研水平已经进展到3-5分区间。此区间的一个重大特征就是数据结构更加完整，必须要有分子机制。这个区间的分子机制大多是间接作用机制为主，是信号通路的机制。 此时你需要聚焦到某一个通路，围绕其相关分子做一些western的检测。怎么聚焦到这个通路呢，可能前期还要有一些芯片的筛选。在这个层次中，如果用到了我在第13策和14策当中介绍的方法，我相信是比较容易搞定的。 最后那些有理想有情怀的青年，要想发5分以上paper，那么要有一个完整的数据结构，如前所说的4个部分，临床相关性研究，细胞表型研究，分子机制研究和动物模型验证。 还需要注意几点。临床相关性研究除了TCGA一定要有自己的标本，而且样本量不要太小，至少80-100例。 在细胞表型研究中至少要提供2株细胞的表型证据，如果严谨一点还要尝试做一正一反各2株细胞，即过表达和RNAi基因沉默。 在通路机制上，要比前面说的3到5分多做一步，即rescue实验，这在之前的课里也讲过很多次了哦。 最后是动物实验，要取动物的肿瘤组织，做免疫组化也好，qPCR、Western也好，要把这个靶分子有可能影响的一些下游分子的表达变化趋势，跟细胞水平对起来。 整体研究设计需要花多少钱？ 说完了文章框架的问题，接下来就是钱。有时候有发5分的心，但是手中只有发1分的钱，太尴尬。咱们再来看看这几部分的预算。 先说说临床相关性研究， TCGA挖数据本质上没有预算，除非把它全部包给公司做。验证样本80~100例，要是自己做实验主要就是抗体的钱。组织芯片是比较好的研究工具，一张片子能做几十上百例，省抗体，要不大片一张一张做，100张估计1支抗体是不够的。 免疫组化太常用了，很多医院的病理科也提供这样的服务，十几二十块一张片子不含抗体，可以找他们合作。也有公司做免疫组化的服务，甚至常规通路的抗体直接在抗体库里给提供了。所以这部分的预算根据样本量的多少会有较大偏差，几千到一两万不等，就算全部外包大抵不会超过2万。 第2部分是细胞和分子实验，主要是分子载体、病毒要采购，大概1万。还要培养细胞，买相应试剂，做表型实验也有相应试剂盒，自己做实验的费用大概在2万左右；如果这也外包，可能还要再加1万左右的人工费。 现在3万左右搭出去了对吧，很多人就已经发现手上没钱了，接下来还有通路机制和动物实验呢，想想要不要做呢。 如果要做通路机制探索，则很有助于提升文章档次，预算其实也不多。推荐策略是蛋白芯片的通路筛选，加上抗体的western验证。因为蛋白芯片技术也是基于抗原抗体反应，重复性较好。芯片几千，再加抗体自己做验证，估计1-1.5万就能补上机制的数据。 如果再做rescue实验就稍麻烦，还要订购这个通路的抑制剂、激活剂，甚至要订购病毒做基因操作，还要再重复表型实验，约1万。所以简单通路就是1万，再做深一点的验证则大概2万。 最后是动物实验。如果自己做就是买动物和饲养的费用，如果是外包就主要是人工费用。动物实验只做表型的话，一般几千到一万就够，如果在机制上再做补充实验的，就还要取瘤子，观察一些指标，或者拍活体荧光，就会增加预算。 总的来说，整个实验如果完全自己操作，预算约5-6万，预期是能发到3-5分，好的话可以发过5分。如果同样的工作量外包，预算至少要翻番。以酸菜自己运营实验室的经验来说，试剂费用只占整个实验室运营费用的20%，这就意味着如果买试剂是1万，要外包差不多是5万。 此类研究的客观风险在哪里？ 分析完这些可能大家感觉信心满满，我有钱有时间，撸起袖子就能干了。但这里要给大家稍微浇浇冷水，因为科研不是像你想象这般的美好，对其客观风险也要有所准备。 筛选基因加验证表型是常规的功能基因组研究策略，但也存在大量风险，解决之道除了经验和运气，比较靠谱的方法就是要多有备选，即上期说的用通量解决概率问题。 实验中我们经常遇到过表达或者沉默一个基因，选了不同的载体则效果不同，可能细胞转染效率低下，或者稳转株做不出来，细胞到后边就不长了，又或者稳转株表达了一段时间，发现该沉默的它又恢复了。 有时候敲降了一个基因，在mRNA水平检测其表达是降低的，但是检测蛋白就又不像mRNA趋势那么明显，这也意味着有可能这个基因受到了一种转录后的调控机制。 这么多实验风险使整个研究有了很多不确定性。可能细胞即使有了表型，再回过头来检测临床样本还不一定相符，此时幸好前面还有TCGA的数据，大不了标本少做一点，或者干脆不做了。 很多paper只会展示一些配对标本的检测结果，可能就几例，没有自己标本的临床相关性统计分析，也许不是没做，可能是做了之后发现结果跟TCGA不一样，没法解释。 现在你有了表型还发不了比较好的文章，还必须用机制去回答why，这是我们最需要突破的障碍。 我们还会遇到细胞水平的数据和动物水平的数据不可重复，细胞有表型结果上了动物就做不出来，或者说有些细胞做了稳转株，不成瘤，就是对照组都不成瘤，这实验就没法做了。 这些问题都是客观风险，大家在开展研究之前一定要有清醒的认识，科研是一步步试错的过程，如果经验丰富，每一步试错都有风险预案，可在设计实验时做更好的设计去避免。 总的来说当你有一颗小种子的时候，基本上这篇文章就有了，但是这篇文章是能做到3分还是5分甚至更高，除了基因的原创性之外，还跟后面的客观风险有关，有时候数据做了一堆，但是有用的很少，提醒大家注意。 文章出来后，后续基金项目如何申请？ 有些基金申请人前期功能基因组、筛基因、验证表型、做机制等等工作都做好了，但是申请基金依然不好操作，为什么呢？ 常见的一个问题是前期发文章的时候选的靶基因不够新颖，都是已经在其他癌种中报道过、有表型的，移植到自己的癌种中。这样的策略发文章的确比较保险，但是申请国家级基金则创新性明显不足，如果申请省市级小项目，可能对创新性的要求还没有那么苛刻。 还有些同学前期预算太少，只能做做表型，TCGA分析一下，发一篇小文章，机制没有了。这种情况下第一要务就是在有确定的表型的前提下，设计做机制的研究，以此申请基金，只不过这样的前期工作相对薄弱。 如果前期文章有表型和一些机制的预实验，就可根据预实验的情况来对某个通路的某个靶点或者是某个关键的调控分子进行更深入的阐述和设计了，这才是国家基金的级别。 如果前期文章已经有比较充分的机制实验，比如下游信号通路已经做好，此时的策略可以在上游再找一个调控因素，比如上游影响它的甲基化因素、转录因子等，对它再进行深入的探讨和研究。这又形成2个变量之间的相互作用，也是国自然的水平。 如果前期文章其实已经做的较为深入了，下游通路的分子靶点也找到了，相互作用也做了，文章也发的很好，这样其实这基金基本已经是你的了，你只要把申请书写好就行。前期工作有1篇5分的paper，A类过会的几率就很高了。 还有一个经常在基金申请中用到的策略，就是已经有一个靶分子时，可以通过前期的预实验，比如做一下pull down实验，找一下它有没有其他的相互作用的蛋白，或者做一个RIP（RNA结合蛋白免疫沉淀），找一下它有没有相互调控的lncRNA，在项目中引入一个新的分子，也可以形成一个新的课题。 总结一下： 1）申请基因的策略主要是在有表型前期数据的情况下往机制上延伸，通过机制的预实验去找一个方向深入研究； 2）在已经有下游的情况下，考虑从上游找因素进行研究设计； 3）或者直接从分子-分子交互作用，找一个新分子作为研究方向，而前面这篇文章，就作为这个新分子引出的铺垫。 这基本上是现在基金申请中大家可能遇到的几种问题的解决方案。 本文整理自酸谈公开课《TCGA筛到了基因，我该如何往下做？》更多生信数据库的使用经验和技巧，欢迎扫二维码听课~ |
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