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你的标书内容如果全实现，你觉得可以发几分SCI文章？20分很轻松，CNS也是可以冲一冲。为啥最后只能发个3、5分的结题？那因素可就多了去了。 一方面分子机制验证不成功，一方面技术路线设计的不合理，经费早早花完了等等，还有很多其他因素。 你的标书 pk 结题报告 标书既不能让专家觉得设计不合理甚至是胡扯，也不能遗漏了实验，钱少要了，咱们通过一篇10分的lncRNA的文章，依葫芦画瓢！ 关键词：lncRNA、自噬、p53、转录因子、缺血再灌注
（1）选择细胞模型、动物模型(C57BL/6) 作者是研究心肌细胞方向的，肯定一比较熟悉的几个心肌细胞系、动物为模型了 首先要得到心肌细胞，你可以购买商业化的，也可以自己制备原代细胞，这个比较难。 作者选择自己制备小鼠C57BL/6心肌原代细胞。
（2）确认研究方向（自噬）并遴选靶基因 肯定是抱紧热点的大腿了，作者选择了研究自噬（Autophagy），企图想要发现细胞发生自噬时那些基因发生了差异表达。 作者构建细胞自噬模型，确认构建方式、检测自噬相关markers。 ①模型构建方式：H2O2可介导心肌细胞产生自噬反应。 ②自噬模型鉴定：检测表型和分子marker来鉴定。这里呢表型就是电镜检测自噬小体（autophagosome）的形成，自噬蛋白GFP-LC3-Ⅱ的胞内定位，以确认自噬激活。 ③差异基因的遴选：往往这个时候需要大海捞针，但作者已有要检测的靶基因，那就是myocardin蛋白，此时好办多了，Q-PCR、WB检测其表达量变化。 Myocardin呈现时间依赖性高表达
技术小结：自噬鉴定方法。 自噬激活时，LC3-Ⅱ聚集于自噬体膜上。通过转染GFP-LC3融合蛋白的表达，理论上，根据GFP荧光颗粒聚集的密集程度和分布可反映Lc3的表达水平和细胞内定位，因此可以判断细胞自噬的发生情况。
（3）靶基因myocardin的体外功能鉴定-敲减 这一部分是为了验证遴选的靶基因是否真的参与了自噬，而不是只是一个路人乙。 它的敲减（KD）或者过表达（OE）能挽救细胞表型（自噬）吗？ 那么这里就应该是敲减处理(knockdown)，因为自噬状态下myocardin是高表达，看能否挽救自噬发生，用siRNA敲减myocardin。 荧光显微镜&细胞计数：表型上自噬被抑制(单个细胞、群体数量统计)，细胞凋亡减少 WB：自噬marker LC3-Ⅱ形成的过程被抑制
（4）靶基因myocardin的体内功能鉴定-敲减 好了，细胞上咱们验证了，那么体内实验呢？构建myocardin敲减的小鼠模型，行缺血再灌注，因为缺血再灌注损伤和自噬被证明是正相关的。 表型检测：myocardin敲减后，小鼠IR损伤导致的梗死面积明显下降
至此，myocardin能抑制自噬激活的证据也算是在体内和体外被做实了。 想发文章了？想毕业了？你老板同意吗？ 接下来就是它的分子机制了，烧钱烧脑的部分要来了。
（5）myocardin→？→自噬激活 咱们顺藤摸瓜，首先咱们要搞清楚myocardin的和明星分子的关系。 Myocardin的下游明星分子：哪些分子和自噬有关，啪啪啪地就可以列举一大堆，作者检测Atg5, Atg7,Atg10, Beclin 1这些。 最直接的办法莫过于在体外的心肌细胞中过表达一下myocardin，做WB了，Beclin 1被上调表达。 其实还可以继续做myocardin如何调控beclin 1的，并没有人做过，不过作者此文中聚焦于myocardin的上游分子机制
（6）？→myocardin→beclin 1→自噬激活 这个问题就会很大，首先要确认Myocardin的丰富改变的维度，也就是mRNA的表达是否变化。 Q-PCR确认了mRNA是变化的，但是我们都知道mRNA的成熟加工过程， 1.DNA转录 2.pre-mRNA的加工 3.mRNA的甲基化调控
做哪一部分都很花钱啊，没办法你只能本着自己熟悉的实验和方向来做(创新是要付出金钱的)。 作者选择了DNA转录调控的研究，这个时候就需要做ATAC-seq去研究是哪些转录因子结合在myocardin的启动子区了，不过这个得花个几万块钱啊，基金的钱还够吗？ 想想还是算了，作者选择了生生地转录因子预测：myocardin的启动子区有p53的结合序列 （从genecards里面有几百个转录因子预测啊，作者是怎么就知道是p53啊，不管了，总之人家做出来了，尽管是个bug）
那怎么证明转录因子结合了某段DNA序列，促进转录呢？ 实验1：双荧光素酶报告系统，是为了证明转录因子功能上促进基因转录的，并不能证明转录因子和DNA序列结合。
实验2：心肌细胞中p53转录因子的敲减和过表达，也能证明功能上的上下游关系，能证明自噬的激活，也不能证明转录因子和DNA序列的直接结合。
实验3：如何证明转录因子和DNA物理上有结合呢？ChIP-q-PCR
（7）？→p53→myocardin→beclin 1→自噬激活 这里涉及的科学问题如上所述 十字路口怎么选择啊？毕竟钱不多了啊，既然这个分子机制中包含了转录调控，p53的核定位发生了改变，那一定是有原因的，为了能够蹭上另外一个大热点非编码RNA（lncRNA、circRNA等），要做哪个实验呢？ 技术路线中你可以有两个选择 选择一：p53是个蛋白，和RNA扯上关系的实验，就是RIP-seq了，测测lncRNA。 选择二：第二种就是自噬激活和正常的心肌细胞，做RNA-seq或者芯片，选择差异的lncRNA，但不能判定lncRNA能否与p53结合与否，而作者选择的是这种方法。
（8）lncRNA CAIF结合p53→myocardin↓→beclin 1↓→自噬抑制 对lncRNA通过RIP实验结合p53，阻止myocardin调控轴，自噬抑制 接下来就是对lncRNA CAIF一顿体外、体内功能验证的操作，总之就是对每个分子都做下体内外的敲减或者过表达操作，检测表型变化。
于是我们总结了如下套路： ①确定课题方向，选定细胞、动物模型，遴选相关基因，寻找上下游分子，每个分子都做下细胞动物功能实验； ②找到靶分子之后，可以往上游深入亦可以往下游深入，找到2、3分子调控网络就可以发高分了，花钱是避免不了的； ③为了寻找相互作用通常不止一种方式，可以从分子本身下手找结合分子，也可以从构建好的模型本身寻找差异分子，确定上下游之后再逐渐拉近距离； ④互作寻找时有促进或者抑制两个维度可以选择； ⑤结合数据库预测、公用数据库的现有测序or芯片数据。
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