|
吉凯高分文章解析系列，今天为您带来的是2017年8月发表在Nature（IF：40.13）上的，利用CRISPR/Cas9文库技术筛选影响T细胞杀伤效果的关键基因的一篇文章。
我们都知道体细胞的突变会影响肿瘤细胞对于T细胞免疫治疗的敏感性。体细胞突变会影响T细胞对肿瘤细胞的杀伤，本文作者用黑色素瘤模拟肿瘤杀伤时的失活突变。作者所采用的方法是针对20000个基因的全基因组的CRISPR/CAS9文库系统，在这个文库系统中，包含123000条sgRNA，即每个基因设计六个靶点进行基因敲除，筛选敲了哪些基因影响效应CD8细胞杀伤能力。文章发现抗原呈递和IFN-GAMMA是在其中起到关键作用的。作者比较不同细胞系和抗原，发现了APLNR基因（一个脂肪炎症因子受体）的失活突变会导致肿瘤细胞对免疫治疗很耐受。同时，本文的机制研究部分，验证了APLNR和JAK1相互作用，调控IFN-GAMA反应。它的缺失导致细胞转移和检查点阻滞的免疫疗法受阻。 这篇文章所用的系统是双细胞crispr筛选系统。其中，靶细胞是常用的ESO-1黑色素瘤细胞系，T细胞转染了特异性针对NY-ESO1抗原的TCR。上图为系统示意图。a-c显示病人患者中B2M和TAP这两种与抗原呈递有关系的基因高表达的患者预后好，图d显示了这个双细胞系统工作的原理。e是将不同的两株靶细胞细胞系和T细胞放在一起杀伤比较，结果显示，带有ESO-1抗原的肿瘤细胞被杀得很多。F是将临床已知的抗原呈递基因敲了，结果和预期一致。 A图描述了文库工作的原理：针对全基因组全部基因的每个基因设计6个敲除靶点，包成慢病毒文库。用一部分文库慢病毒去感染肿瘤细胞系，另一部分作为对照，最终比较存活的肿瘤细胞中sgRNA的拷贝数，含有高拷贝数的细胞即代表敲除对应基因会使肿瘤细胞对免疫治疗耐受。图B、C即是通过高通量筛选找到的基因的名字，D是高排名基因的sgRNA有多少条拷贝。通过对D图中的基因进行生信分析，作者找到抗原呈递通路相关被显著富集排（图E）。 后面作者进行了分析数据，C图的CYT是TCGA里面的肿瘤杀伤能力相关基因，结果显示大部分是抗原呈递和IFNγ相关的基因。D是聚类热图分析，也验证了同样的结论。 之后，本文为了验证高通量筛选的有效性，针对单个基因，在不同的癌症和抗原里做实验验证。C可以看到作者换了一个别的黑色素瘤细胞系会产生一些结果差异，但是大部分还是不变。D是换了肾癌细胞系，结果一致。 A是病人样本中使用CTLA4或者PD1以后出现的突变，B是说这些突变的基因功能是差一些的。筛选发现JAK1通路在敲了APLNR后变化最明显。下面图defg是各种体外验证。H是一个体内验证，B16细胞敲了APLNR后对T细胞更加耐受。至此，作者得出结论：APLNR和JAK1通过相互作用调控IFN-GAMA反应，该基因的缺失导致细胞转移和检查点阻滞的免疫疗法受阻。 |
|
|
