抗体药物偶联物的构建——连接位点与连接基团的选择

1.抗体药物偶联物概念

抗体药物偶联物(antibody-drug conjugate，ADC)是通过一个化学链接将具有生物活性的小分子药物连接到单抗上，单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，目前应用最广的是针对肿瘤细胞的递送。利用小分子药物的细胞毒性杀死肿瘤细胞是许多化疗药物的机制，然而为了追求更好的治疗效果，小分子药物的细胞毒性往往很强。由于选择性不足，导致对于正常细胞也存在着杀伤，进而导致对机体的伤害。最大耐受量和最小有效剂量之间的剂量范围即为治疗窗，药物选择性的不足导致治疗窗变得狭窄，这给临床用药带来了不便。

提高药物的选择性，是拓展治疗窗的一个手段。抗体是一类具有特殊亲和力的蛋白，利用其对靶细胞特异性的结合，有望作为药物靶向递送的载体，进而提高药物的选择性。

图1  药物治疗窗示意图

2.首个抗体药物偶联物药物

    辉瑞旗下的Mylotarg（gemtuzumab ozogamicin）是首款得到美国FDA批准，用于治疗表达CD33抗原的新诊断急性骨髓性白血病（AML）成人患者的抗体药物偶联物。Mylotarg含有可以靶向CD33的单克隆抗体和与之连接的细胞毒素卡其霉素（calicheamicin）。CD33是一种在成髓细胞表面表达的抗原，在多达90%的AML患者中都存在。Mylotarg通过与CD33抗原结合实现对肿瘤细胞的靶向效应。该类药物的成功上市证明了抗体药物偶联物作为药物的可能性与广泛应用前景。

图2  Mylotarg结构式 （来源：adcreview.com）

3.抗体与药物连接位点的选择

对抗体进行药物偶联时，往往使用带有特殊侧链的氨基酸作为反应位点。其中以半胱氨酸和赖氨酸为最多。半胱氨酸在抗体中以二硫键的形式存在，因此需要对其进行还原为自由巯基进行下一步反应。其中在抗体（IgG）链间有4对二硫键，比较容易被还原。而在抗体链内，有12对二硫键，较难被还原。赖氨酸则广泛分布于抗体结构域，大约有86个赖氨酸残基，其中有大约20个赖氨酸残基可作为连接位点。除选择氨基酸残基外，选取保守糖基化的多糖作为修饰位点也是可行的。

图3  半胱氨酸，赖氨酸结构及在抗体（IgG）位置

4.连接基团的选择

    连接基团的基本要求是稳定性，主要是在水环境和体内环境中的稳定性。该类偶联物在体循环中不能发生降解，以避免药效的降低和副反应的发生。另外连接基团还能够在一定条件下被降解，以完成药物的释放。

（1）形成酰胺键类连接基团：该类连接基团在反应后形成酰胺键，完成对药物和抗体的偶联。酰胺键的优点是反应比较简单，且形成的偶联物比较稳定，不易在体循环中断裂，因此可以扩大治疗窗提高机体对药物的耐受性。然而缺点也显而易见，即偶联物对大多数条件均稳定，导致药物释放机制单一，往往只能依赖溶酶体进行降解，难以设计复杂的递送策略。

图4  形成酰胺键的连接基团

（2）形成腙的连接基团：在反应后形成腙，完成对药物和抗体的偶联。腙可以在酸性条件下水解，由于人体体循环中pH值接近中性，故该类偶联物在血浆中稳定。而肿瘤微环境和肿瘤细胞内部酸性较强，则药物可被释放。例如药物BR96-Doxorubicin的设计即使基于此原理。然而其缺点是腙不够稳定，会发生在血液中的释放。这种在病灶范围之外的药物释放是有害的，会导致药物不耐受和免疫反应，因此使用这类连接基团时，对于安全性评估应格外慎重。

图5  形成腙的连接基团

（3）形成二硫键的连接基团：二硫键形成后完成对药物的偶联，二硫键在一般条件下稳定，在体循环中不会断裂。而由于肿瘤内部谷胱甘肽还原系统还原型谷胱甘肽达到正常细胞胞浆中的1000倍，因此在肿瘤细胞中可以断裂，完成药物释放。另外肿瘤细胞也含有蛋白质二硫键异构酶家族中的酶，也可以促进二硫键的断裂。使用这一策略，可以实现偶联物的可控断裂，进而实现药物的靶向递送。

图6  形成二硫键的连接基团

（4）使用短肽作为连接基团：基于多肽的连接基团被设计为在体循环中保持偶联物稳定性，并且使得细胞毒性药物可以在特定的酶切割下被释放出来。由于可以设计出不同功能的序列，因此可以针对pH稳定，针对一些酶稳定，而只对特定酶（例如组织蛋白酶B）敏感。进而完成药物在特定细胞的靶向释放。

图7  引入短肽作为连接基团

5.结语与展望

单抗作为载体将小分子药物靶向运输到目标细胞中，可以提高小分子药物对不同细胞的选择性，进而拓展治疗窗。因此抗体药物偶联物是一类在肿瘤治疗中非常有用的药物，在构建这类偶联物时，除了关注小分子药物本身，单抗种类的选择，也应关注到连接基团的选择。其主要思路是通过合理的断裂策略实现药物的靶向递送，进而提高治疗效果。不同连接基团和不同连接位点的选择可以实现对药物递送方式的设计，进而实现不同的治疗效果。在设计这类连接基团时，应充分考虑其化学性质和生物学性质，使得设计出的连接基团能够适应临床治疗的需要。

参考文献

1.Agarwal, P.; Bertozzi, C. R., Site-specific antibody-drug conjugates: the nexus of bioorthogonal chemistry, protein engineering, and drug development. Bioconjug Chem 2015, 26, (2), 176-92.

2.Axup, J. Y.; Bajjuri, K. M.; Ritland, M.; Hutchins, B. M.; Kim, C. H.; Kazane, S. A.; Halder, R.; Forsyth, J. S.; Santidrian, A. F.; Stafin, K.; Lu, Y.; Tran, H.; Seller, A. J.; Biroc, S. L.; Szydlik, A.; Pinkstaff, J. K.; Tian, F.; Sinha, S. C.; Felding-Habermann, B.; Smider, V. V.; Schultz, P. G., Synthesis of site-specific antibody-drug conjugates using unnatural amino acids. Proc Natl Acad Sci U S A 2012, 109, (40), 16101-6.

3.Lu, J.; Jiang, F.; Lu, A.; Zhang, G., Linkers Having a Crucial Role in Antibody-Drug Conjugates. Int J Mol Sci 2016, 17, (4), 561.

4.Yao, H.; Jiang, F.; Lu, A.; Zhang, G., Methods to Design and Synthesize Antibody-Drug Conjugates (ADCs). Int J Mol Sci 2016, 17, (2).