样品前处理丨脂质的提取（脂质组学）

脂类的提取主要是用的是由Folch[1]和Bligh-Dyer[2]提出的通用的方法，通常会在溶剂使用量和分析基质上做一些改变。Folch的方法使用氯仿/甲醇（2:1，v/v）作为提取溶剂，而Bligh-Dyer的方法使用氯仿/甲醇（1:2，v/v）作为提取溶剂，接着加入1体积的氯仿和1体积的水。氯仿的毒性较大，所以也可以使用毒性较小的二氯甲烷来代替。在使用这些传统的方法时，目标组分收集过程可能会有一些问题产生，因为目标组分在两相溶剂的下层，收集提取液时需要将枪头穿过上层溶剂进入下层溶剂进行吸取，可能会使提取物受到污染。这个问题可以使用甲基叔丁基醚（MTBE）作为提取溶剂进行解决，将MeOH和MTBE（1:5.5，v/v）加入血浆中，接着加入1.25倍量的水使其分层[3]。分层之后，脂类化合物存在于密度较小的有机溶剂中，处于上层，因此使得收集提取溶液变得很容易。另外，相比与氯仿，MTBE毒性很小。这种方法被证明可以提取大多数的脂类化合物（PC、SM、PE、LPC、Cer、ChoIE、TG），且有较高的回收率。

 

最近研究发现，使用Bligh-Dyer方法和MTBE/甲醇进行样本前处理时，对于LPA和PA类化合物的回收率较低。相比于传统的Bligh-Dyer方法，向Bligh-Dyer提取系统中加入0.1M的盐酸可以将7中PA类化合物的提取回收率提高约1.2倍，同时可以将6种LPA类化合物的提取回收率提高15倍。同时，在此方法中也并未观察到由于盐酸的加入而对磷脂类化合物产生水解作用[4]。

 

有研究者也建立了一种自动的方法用来提取血浆中的脂类化合物，且方法中也未使用毒性较大的氯仿[5]。在此方法中，血浆首先与丁醇/甲醇（3:1，v/v）溶液混合，接着用两相溶剂庚烷/乙酸乙酯（3:1，v/v）进行提取。对于主要的脂类物质（ChoIE、cholesterol、TG、PC、SM、Cer、DG、LPC），此方法可以获得与Folch类似的回收率。

 

使用丁醇/甲醇（1:1，v/v）对血浆样本进行提取，可以更高效的对脂类化合物（包括甾醇，甘油脂，甘油磷脂和鞘脂等）进行提取[6]。此方法所使用的溶剂与常用的液质联用的初始洗脱梯度相互兼容，因此提取液可以不用在进行溶剂挥发和复溶的步骤而直接进行质谱分析。

 

使用甲醇、乙腈或其与水的混合溶剂进行蛋白沉淀也可以用来进行样本前处理，但是相比于经典的Bligh-Dyer方法，相当一部分的脂类化合物的提取效率非常低。也有研究指出在进行血浆中脂质的提取时，如果使用异丙醇来进行蛋白沉淀，可以获得较高的回收率。

 

固相萃取（SPE）也一直被用于分离脂类化合物。有研究就使用类似96孔板的固相萃取板用来分离血浆中的胆汁酸类和脂氧化物类化合物[7]。通常，SPE常被用来去除影响下一步液质分析的杂质，选择性的提取某一类需要深入研究的脂类化合物。

 

参考材料：

1. Folch, J.; Lees, M.; Stanley, G. H. S. J. Biol. Chem. 1957, 226, 497-509.

2. Bligh,E. G.; Dyer, W. J. Can. J. Biochem. Physiol. 1959, 37, 911-917.

3. Matyash, V.; Liebisch, G.; Kurzchalia, T. V.; Shevchenko, A.; Schwudke, D. J. Lipid Res. 2008, 49,1137-1146.

4. Triebl, A.; Trotzmuller, M.; Eberl, A.; Hanel, P.; Hartler, J.; Kofeler, H. C. J. Chromatogr. A 2014, 1347,104-110.

5. Lofgren, L.; Stahlman, M.; Forsberg, G. B.; Saarinen, S.; Nilsson, R.; Hansson, G. I. J. Lipid Res. 2012, 53,1690-1700.

6. Alshehry, Z. H.; Barlow, C. K.; Weir, J. M.; Zhou, Y.; McConville, M. J.; Meikle, P. J.Metabolites 2015, 5, 389-403.

7. Han, J.; Liu, Y.; Wang, R.; Yang, J.; Ling, V.;Borchers, C. H. Anal. Chem. 2015, 87, 1127-1136.

未完待续

扫一扫关注我们，
更多咨询早知道！