手把手教你流式细胞周期检测（一）

细胞周期（cell cycle)：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA复制成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。从DNA含量我们同样无法区分G2期和M期。

流式细胞仪工作原理：

    将待测细胞放入样品管中，在气体的压力下进入充满鞘液的流动室。在鞘液的约束下细胞排成单列由流动室的喷嘴喷出，形成细胞柱。通过对流动液体中排列成单列的细胞进行逐个检测，得到该细胞的光散射和荧光指标，分析出其DNA特征。

细胞周期检测的原理：

    PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。PI染色后，假设G0/G1期细胞的荧光强度为1，那么含有双份基因组DNA的G2/M期细胞的荧光强度的理论值为2，正在进行DNA复制的S期细胞的荧光强度为1-2之间。

图片来自网络

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材料准备

6孔板；15ml离心管；胰酶；RNase-A；PI；无水乙醇（四度冷藏）；PBS

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仪器设备

流式细胞仪；离心机；水浴； 锡箔纸

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实验步骤及注意事项：（以细胞加药为例）

细胞样品的准备

细胞消化和固定后不可过度吹打,防止细胞碎片

1. 细胞培养:六孔板种下细胞，每孔1.5*10^6个,细胞处于生长对数期,50-80%贴壁后换含药培养液（三复孔）,处理相应时间后，收细胞检测(单次流式细胞仪检测，1份样品细胞数量约106)

2. 细胞处理：胰酶消化含血清培养基中和，2000 rpm 5 min，用预冷PBS重悬洗涤，小心地吸去上清,残留约50ul,不要倾倒;

3. 细胞固定：1ml PBS充分重悬，成单细胞，轻轻边vortex，边缓慢滴加3ml预冷的无水乙醇，至终浓度75%，4度静置过夜（18-24h），-20度长期保存一个月（预约流式细胞仪）

4. 将过夜固定好的细胞用预冷PBS 洗两次，2000rpm 5min去除 PBS 后加入200 ul PBS(约400ul)，为减少细胞损失可用1.5ml离心。移至1.5ml EP管中, 轻轻弹击离心管底，以适当分散细胞，避免细胞成团。

5. 加入20 μLRNase（储存浓度25 mg/mL，PBS 稀释成1mg/ml，工作浓度50ug/ml），重悬细胞，37 ℃水浴消化 30 min；

6. 加入PI 20ul至终浓度50ug/ml（储存液浓度25mg/ml, PBS稀释1mg/ml加入10ul）锡箔纸包住，避光4度染色30min，24h内上机检测。

7. 充分混匀细胞，用 200 目滤网过滤后，便可利用流失细胞仪进行细胞周期

8. 数据的收集和分析
   

      流式检测和分析：用流式细胞仪在激发波长488nm波长处检测红色荧光，同时检测光散射情况。采用适当分析软件进行细胞DNA含量分析和光散射分析。

注意事项

1. RNaseA用PBS配制，但是注意水浴去除DNase的活性。

2. 流式分析时需要的是单个细胞悬液，因此在操作过程中充分混悬细胞。

3. 固定过程中不直接加70%乙醇的原因是：直接加入乙醇会导致细胞团聚的现象，很难重悬，成单细胞。乙醇固定之后没有细胞沉淀。

4. PI液体4℃避光保存。

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