5株优良抑菌活性乳酸菌对全株玉米青贮品质的影响

阿牛哥8mi3kbb7 2018-02-10

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导读

青贮过程是一个复杂的微生物发酵体系，如何快速的让乳酸菌迅速地成为优势菌群主导发酵过程是提高青贮质量，减少干物质和能量损失的核心问题，为弥补发酵底物中乳酸菌数量的不足，添加优良乳酸菌以调控该微生物发酵体系是一个行之有效的方法，已经有许多成功的例子。如在意大利黑麦草（Lolium multiflorum）中添加乳酸菌使PH值及挥发性氮与全氮比值降低，提高了L（+）乳酸的生成比率，改善了青贮饲料发酵品质。一般认为，同型发酵乳酸菌因乳酸产率高，能迅速降低青贮饲料的pH值而抑制有害微生物的活动，从而能改善青贮饲料的发酵品质；异型发酵乳酸菌虽然累积乳酸的能力不如同型发酵乳酸菌，但其除了能产生乳酸外，还可产生能有效抑制需氧性微生物如酵母菌和霉菌的乙酸，从而抑制青贮开封后的二次发酵，提高有氧稳定性，减少取用和饲喂过程中的营养损耗。目前，已报道能提高青贮饲料有氧稳定性的乳酸菌主要是布氏乳杆菌（Lactobacillus buchneri），如全株玉米（Zea mays）中添加布氏乳杆菌进行青贮，可降低青贮饲料的乳酸浓度，提高乙酸浓度，降低酵母菌数量，提高青贮饲料的有氧稳定性。目前，国内外已有许多生物添加剂成功应用于饲料青贮，但由于这种生物添加剂受环境影响较大，出现了一些不同的研究结果。因此，筛选更多的能促进青贮发酵、改善青贮饲料品质并具有抑制青贮饲料二次发酵潜力的优势乳酸菌势在必行。

作为青贮添加剂的优良乳酸菌必须具有较强的附着能力和生长能力，而从青贮原料或青贮饲料中分离筛选乳酸菌最容易满足以上要求。虽然关于玉米青贮的乳酸菌已有较多报道，但还没有适合甘肃地区全株玉米青贮的乳酸菌接种剂，本实验室前期从甘肃各地玉米秸秆青贮饲料中分离筛选获得5株青贮用优良乳酸菌，其中植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）B3-1产酸较快、较多，且其培养上清液对供试的金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌和酵母菌均具有较强的抑菌活性，肠膜明串珠菌肠膜亚种（Leuconostoc mesenteroides subsp.mesenteroides）B1-7、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）B2-3、屎肠球菌（Enterococcus faecium）B5-2、发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）E2-3分别在分离的同类型乳酸菌中产酸和抑菌特性均最优。分别将以上5株乳酸菌作为接种剂，在实验室条件下开展全株玉米青贮试验。结果发现，在青贮过程和有氧暴露后，分别添加5种筛选乳酸菌的各处理组乳酸菌总数均显著高于对照组，而好氧细菌、酵母菌和霉菌数量均显著低于对照组，pH亦低于对照组，其中植物乳杆菌B3-1处理组差异最为显著，表明这5株乳酸菌尤其植物乳杆菌B3-1具有提高青贮饲料品质和抑制二次发酵的潜力。为验证其对全株玉米青贮发酵过程营养和发酵品质的影响，本研究通过跟踪分析青贮过程不同阶段青贮饲料的营养成分、有机酸和氨态氮的动态变化，综合评价接种的乳酸菌对全株玉米青贮的调控效果，进一步验证和筛选在青贮发酵过程不同阶段起主要作用的优良乳酸菌，为进一步组合制备更适合甘肃地区全株玉米青贮用复合乳酸菌接种剂提供依据。

1材料与方法

1.1 菌种与仪器

供试乳酸菌包括：肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7、戊糖片球菌B2-3、植物乳杆菌B3-1、屎肠球菌B5-2、发酵乳杆菌E2-3均由本实验室分离鉴定并保存。

仪器：723N可见分光光度计、DZ-300A多功能真空封口机、22cm×28cm聚乙烯包装袋、茂福炉、蛋白消煮炉、DHG-9000A立式电热鼓风干燥箱、E2695高效液相色谱仪。

1.2 青贮饲料的调制

2012年9月，自甘肃农业大学动物科学技术学院产学研基地（甘肃省临洮县）采集蜡熟期青贮用全株玉米，经切割机切成1～2cm左右混匀即为青贮原料，用微波炉进行快速干燥，以掌握含水量，当萎蔫至含水量达到70％左右（过夜）进行青贮。各供试乳酸菌用MRS（deMan-Rogosa-Sharpe）液体培养基培养至对数生长期，调浓度为1×10⁹cfu/mL，按5 mL/kg青贮原料添加，即5×10⁶ cfu/g。试验设6个处理：肠膜明串珠菌肠膜亚种B1-7组（B1-7）；戊糖片球菌B2-3组（B2-3）；植物乳杆菌B3-1组（B3-1）；屎肠球菌B5-2组（B5-2）；发酵乳杆菌E2-3组（E2-3）；不添加乳酸菌的液体MRS培养基为对照组（CK）。

将菌液用灭菌喷壶均匀喷洒于切碎的玉米秸秆上混匀。按500g/袋装入聚乙烯包装袋中，按紧、压实，利用真空封口机抽气封口，每个处理30个重复。于恒温环境（20℃）中进行发酵，分别在青贮第3、7、15、30天取样，每处理每次随机取3袋，测定相关指标。

1.3 营养成分分析

采集的青贮样品于65℃烘干后粉碎过0.425ｍｍ（40目）筛，干物质（dry matter，CP）、粗蛋白（crude protein，CP）、可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates，WSC）、中性洗涤纤维（neutral detergent fiber，NDF）、酸性洗涤纤维（acid detergent fiber，ADF）等的分析按照《动物营养学实验教程》中的方法进行。

1.4 发酵品质分析

乳酸（lactic acid，LA）、乙酸（acetic acid，AA）、丙酸（propionic acid，PA）和丁酸（butyric acid，BA）的含量分析采用液相色谱法，在兰州大学化学测试中心进行；氨态氮（ammonia nitrogen，NH₃-N）含量测定采用苯酚－次氯酸钠比色法进行，以NH₃-N 占总氮（total nitrogen，TN）的百分比表示。

1.5 统计分析

用SPSS19.0软件对试验数据进行方差分析和多重比较，试验结果采用平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异显著。

2结果与分析

2.1 玉米青贮原料营养成分

青贮前全株玉米粉碎后测定的营养成分结果如表1所示，原料的含糖量和含水量符合青贮饲料调制要求。

2.2 不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段ＤＭ的影响

不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段DM的影响见表2，各处理组和对照组的DM含量随发酵进行逐渐减小，青贮前7ｄ各处理组DM含量与对照组差异不显著；从第15天开始有差异，到第30天时各处理组的DM含量与对照组相比均差异显著（P＜0.05），其中B3-1处理组的DM含量最高，青贮过程中DM损失最少，为2.22％，而对照组的损失为4.15％。

2.3不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段WSC的影响

不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段WSC的影响见表3，随着青贮时间延长，各处理组和对照组的WSC含量均逐渐降低，前7d下降较快，之后下降速度减慢，且对照组的WSC含量始终高于各处理组。青贮初期，B1-7处理组和B5-2处理的WSC含量显著低于其他处理组和对照组，从第15天开始，B3-1处理组的WSC含量最低，与对照组差异显著（P＜0.05），但与其他处理组差异不显著。

2.4 不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段CP的影响

不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段CP的影响见表4，各处理组和对照组的CP含量随青贮时间延长均逐渐缓慢降低，青贮最初7ｄ，各处理组和对照组的CP含量无显著差异，从第15天开始，对照组的CP含量显著低于各处理组；第30天时对照组的CP含量是原料的91.0％，相对下降最多，而B3-1处理组变化最小，依然含有原料的96.2％。

2.5 不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段NDF的影响

由表5可见，在青贮过程中，随着发酵的进行各处理组和对照组的NDF含量均逐渐增加，最初7ｄ，变化幅度较小，且各组间无显著差异；从第15天开始，变化幅度明显增加，其中B3-1处理组变化最大，显著高于对照组（P＜0.05），但与其他各处理组差异不显著（P＞0.05）。

2.6 不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段ADF的影响

由表6可见，在青贮过程中，随着发酵的进行各处理组和对照组的ADF含量均逐渐增加，青贮初期各组间无显著差异；从第15天开始，B3-1处理组的ADF含量显著高于其他处理组和对照组（P＜0.05），但其他处理组间及其与对照组差异不显著。

2.7 不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段NH₃-N的影响

不同乳酸菌对全株玉米青贮不同阶段NH₃-N的影响见表7，青贮期各处理组和对照组的NH₃-N含量均逐渐增加，且对照组始终最高，与各处理组差异显著（P＜0.05），B3-1处理组始终较低。

2.8 不同乳酸菌对全株玉米青贮饲料有机酸的影响

青贮发酵第30天产物中有机酸含量结果见表8，各处理组及对照组均未检测到丙酸和丁酸，B3-1、B2-3和B5-2组的LA含量最高，显著高于对照组和其他两组（P＜0.05），B3-1和B5-2组AA含量最高，显著高于对照组（P＜0.05），但与其他3个处理组差异不显著（P＞0.05）。B3-1组LA+AA的含量最高，对照组最低，B2-3组的LA/AA最高，B1-7组LA/AA最低。

3讨论

青贮发酵能否成功取决于以下3个必要条件：适合的微生物菌群结构，即青贮原料中的有益微生物如乳酸菌需达到一定数量，若能达到10⁵cfu/g则有希望获得品质优良的青贮饲料，而有害微生物如腐败菌、酵母菌和霉菌等的数量应相对较低；充足的可溶性碳水化合物，提供乳酸菌发酵产酸所需的底物；适当的物理－化学环境，即通过规范的青贮技术和有益微生物的活动创造厌氧和酸性环境。本试验所使用的全株玉米收获切割后萎蔫至含水量为71.14％，可溶性碳水化合物含量为干物质的14.92％，可满足秸秆类作物表面附生的乳酸菌及添加的乳酸菌生长繁殖的需要；中性洗涤纤维含量比较高，为干物质的52.17％，这一部分是秸秆类饲料利用率的瓶颈，若青贮添加剂中含有分解这类纤维类物质的酶或产酶微生物，不仅有利于乳酸菌的发酵，还能提高青贮饲料的营养价值。

全株玉米是制作青贮饲料的主要原料，只要掌握好合适的水分含量，青贮就容易成功，但其自身的乳酸菌数量往往较低，不能在较短的时间内快速成为优势菌群，从而造成青贮原料营养和能量的损失，且开窖后容易发生二次发酵，引起青贮饲料营养和能量的进一步损失，甚至腐烂变质。在青贮过程中加入乳酸菌制剂可以提高其青贮发酵品质，添加植物乳杆菌能显著降低青贮饲料的pH 值并提高乳酸含量，本试验结果表明，在青贮第30天，添加乳酸菌各处理组的LA和AA含量均显著高于对照组（P＜0.05），表明添加的各乳酸菌均能很好的定植，并能在青贮发酵过程中起到重要的作用；其中同型发酵乳酸菌B3-1、B2-3、B5-2处理组的LA含量相近，显著高于异型发酵乳酸菌B1-7和E2-3处理组，B3-1处理组最高，这主要是因为同型发酵乳酸菌在青贮发酵过程中的主要产物是乳酸。另外，以上3个同型发酵乳酸菌处理组的AA含量也较高，可能与青贮原料上本来附着的乳酸菌的类型和数量有关，推测原料中附着的乳酸菌可能以异型发酵乳酸菌为主。因原料中附着的乳酸菌数量较大，达到8.61×10⁵cfu/g，与添加的乳酸菌数量相当，因此添加的同型乳酸菌快速产酸，抑制了有害微生物的繁殖，同时有利于附着异型发酵乳酸菌的繁殖，导致LA和AA含量均升高。有研究报道同型乳酸菌发酵能提高青贮饲料品质，但是在青贮窖打开后的有氧稳定性降低了，是因为乙酸的产量较低，降低了其抑制霉菌等有害菌的能力，故在青贮发酵试验中乙酸的产量增加也不能片面地认为青贮品质降低。

在青贮发酵初期，各添加乳酸菌的处理组DM、CP、NH₃-N、NDF、ADF和WSC的含量与对照组无显著差异，从青贮第７天开始有变化，到青贮第30天，各处理组的DM、CP、NDF和ADF含量显著高于对照组，而ＷＳＣ和NH₃-N含量显著低于对照组，B3-1处理组差异最为显著，表明青贮发酵过程中添加的和附着的乳酸菌活动消耗了一定量的WSC，同时产生的有机酸抑制了有害微生物活动，抑制了腐败微生物对含氮化合物的分解，从而减少了DM和CP损失，增加了NDF和ADF在干物质中所占比率，其中B3-1处理组的DM 损失仅为2.22％，CP损失为3.8％，NH₃-N占总氮的6.05％，小于10％，品质最优。