定点突变引物设计

迷途中小小书童 2018-02-27

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定点突变引物设计

导读

做蛋白生化的同学，经常需要定点突变关键的氨基酸，例如改变一个或多个氨基酸的极性、亲疏水性等，通过比较突变前后的变化来理解特定氨基酸的作用。这对于各位实验达人来说，本来都是小菜一碟；但是，如果要尝试的突变位点很多（例如对一个蛋白进行丙氨酸突变扫描），引物设计的工作量也很大。这时我们可能会想，如果有一款自动设计突变引物的工具该多好！对于在一线进行实验操作的童鞋来说，重复操作自动化，节省时间就是延长生命。因此，今天小编就给大家介绍一款免费的工具——PrimerX，可以自动设计定点突变引物。

A147T是人源跨膜转运蛋白TSPO最常见的一种突变，与多种神经疾病有关。下面我们就以TSPO A147T突变为例，介绍使用PrimerX自动设计突变引物的方法：

1. 我们首先找到TSPO的CDS区序列和蛋白质序列如下：

ATGCCGGAGAGCTGGGTGCCGGCGGTTGGTCTGACCCTGGTGCCGAGCCTGGGTGGCTTCATGGGTGCGTACTTTGTTCGTGGTGAAGGCCTGCGTTGGTATGCGGGTCTGCAGAAGCCGAGCTGGCACCCGCCGCGTTGGACCCTGGCGCCGATCTGGGGTACCCTGTACAGCGCGATGGGTTACGGCAGCTATATTGTGTGGAAAGAGCTGGGTGGCTTCACCGAAGACGCGATGGTTCCGCTGGGTCTGTATACCGGTCAGCTGGCGCTGAACTGGGCGTGGCCGCCGATCTTCTTTGGTGCGCGTCAAATGGGTTGGGCGCTGGCGGATCTGCTGCTGGTTAGCGGTGTTGCGACCGCGACCACCCTGGCGTGGCACCGTGTGAGCCCGCCGGCGGCGCGTCTGCTGTACCCGTATCTGGCGTGGCTGGCGTTTGCGACCGTGCTGAACTACTATGTTTGGCGTGACAACAGCGGTCGTCGTGGTGGCAGCCGTCTGGCGGAGTAA

MPESWVPAVGLTLVPSLGGFMGAYFVRGEGLRWYAGLQKPSWHPPRWTLAPIWGTLYSAMGYGSYIVWKELGGFTEDAMVPLGLYTGQLALNWAWPPIFFGARQMGWALADLLLVSGVATATTLAWHRVSPPAARLLYPYLAWLAFATVLNYYVWRDNSGRRGGSRLAE

2. 我们以A147T突变引物设计为例，将147位的氨基酸A变为T。我们打开网址http:///primerx/

打开网页后发现有3中突变设计方式，分别是基于DNA序列、氨基酸序列进行设计，以及评价自行设计的引物。为直观起见，我们选择第2项：

I want to design a primer pair based on a mutation in an encoded proteinsequence. 之后进入一系列的操作过程。

3. 第一步我们把CDS序列复制过来，然后点击下面的Translate

4. 这个时候，系统已经将DNA序列翻译成蛋白质序列

5. 接下来就是要输入氨基酸突变的信息，我们要将147位的A变为T，那么输入A147T，从下面的“Mutation type”来看，PrimerX不仅可以设计点突变，而且还可以插入和缺失氨基酸。

6. 突变方式选择User Specified（Advanced），点击Next。此处有多种选项，涉及3种不同的试剂盒；但如果没有自己的试剂盒，则直接选择自行制定User Specified（Advanced）

7. 然后得到了突变之后的氨基酸序列，确认是我们想要得到的氨基酸序列。

8. 表达系统选择E. coli，PrimerX将根据表达体系选择优先密码子进行核苷酸替换。退火温度、GC含量、引物长度的选择都很宽泛，可设为45~80℃，GC 30~70%，20-30 nt。PrimerX默认只能将突变位点设在正向引物上，现将其放在其5’端。Flanking区域，指的是突变位点的的侧翼（Flanking，5’、3’两侧）长度。由于将突变位点放在正向引物的5’端，则5’侧翼（flanking）为0~0，3’端侧翼为引物长度20~30。反向引物，与正向无重叠，则将Distance from mutation（bp）设为-1~-1，指的是反向引物5’端在突变位点首位的左侧1位，正好衔接但不重叠。退火、GC、长度与正向相同（45~80℃，GC 30~70%，20-30 nt）即可。另外，正反向的末端均可设为G/C结尾，以保证引物与模板配对的稳定性。点击Generate Primers。