刘耀光院士发明热不对称PCR，两次升级，助力植物功能基因组学发展

1995年，刘耀光院士发明了热不对称PCR（thermal asymmetric interlaced PCR，TAIL-PCR）。TAIL-PCR是用于染色体步移（Chromosome walking）和T-DNA侧翼序列分离的随机引物PCR方法。TAIL-PCR利用2-3条嵌套特异引物（高Tm值）和一个短的（低Tm值）任意简并引物（arbitrary primer, AD），利用变温超级循环特异性地扩增已知序列的未知侧翼序列的技术。因其简单易行、反应高效灵敏、重复性好、并且成本低廉的优势而被广泛应用于分子生物学与功能基因组学领域，在拟南芥和水稻的大规模T-DNA插入突变体库筛选、T-DNA插入位点的鉴定以及基于PCR的未知序列克隆技术（如根据cDNA克隆启动子）等研究中得到了极其广泛的应用，大大促进了功能基因组学的发展。

2007年，在TAIL-PCR的基础上，刘耀光院士通过修改长任意简并引物（LADs）和引入抑制PCR（suppression-PCR）原理，开发了高效热不对称PCR方法（hiTAIL-PCR），提高了扩增未知侧翼片段产物的成功率并减少了较短产物的产生。但受限于所用Taq DNA 聚合酶的性能和简并性LADs的低扩增性能，所获得的目标产物大小普遍小于1.5 kb。

在前期工作的基础上，刘耀光院士团队利用经过优化的长任意简并引物mLADs，并在预扩增反应中加入一条单一（非简并）辅助扩增引物（AC0）以提高扩增性能，同时利用一种更高效的DNA聚合酶（Phanta High-Fidelity DNA polymerase），大大提高了扩增效率，获得的目标产物片段大小增加到2.5~5 kb。

升级版mhiTAIL-PCR是在hiTAIL-PCR基础上，增加使用单一引物AC0作为扩增引物（mLAD主要起产生结合位点的作用），因而扩增效率较高。另一方面，利用Phanta DNA聚合酶的高扩增能力，以达到扩增效率最大化的效果。

图 mhiTAIL-PCR原理图

升级版的mhiTAIL-PCR通过使用改良的mLADs引物、AC0引物和Phanta DNA聚合酶，能更有效地扩增长的未知侧翼序列，该技术为分子生物学和功能基因组学研究提供了一个强有力的工具，将在植物功能基因组领域，特别是对于无参考基因组植物的基因克隆、启动子分析等方面发挥出更大的作用。