血浆游离DNA在老年骨折患者深静脉血栓形成中的辅助诊断价值

开心100mm05xkw 2018-03-03

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·临床实验研究·

血浆游离DNA在老年骨折患者深静脉血栓形成中的辅助诊断价值

刘巧1,2，吴俊1

(1.北京积水潭医院检验科，北京 100035；2.华中科技大学同济医学院附属梨园医院检验科，武汉 430077)

摘要:目的探讨血浆游离DNA(cfDNA)水平对老年骨折患者深静脉血栓形成(DVT)的辅助诊断价值。方法根据加压双向超声将106例股骨骨折患者分为骨折DVT组50例和骨折非DVT组56例。用荧光染料法定量测定血浆cfDNA浓度，同时检测患者外周血WBC、PLT、C反应蛋白(CRP)、D-二聚体(DD)水平。结果骨折DVT组血浆cfDNA水平为337.38(272.89，436.42)ng/mL，高于骨折非DVT组232.56(208.54，280.89)ng/mL，P<>P均<>P均<>r)分别为0.273、0.365、-0.255，P均<0.01。cfdna、dd诊断dvt的roc曲线下面积分别为0.825、0.733，临界值分别为287.86 ng/ml和3.4="" mg/l="" feu(fibrinogen="" equivalent="">结论 DVT患者cfDNA水平升高，其临床诊断效能优于DD，可作为辅助诊断DVT的生物学指标之一。

关键词：深静脉血栓形成；游离DNA；骨折

游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)是一种网状的细胞外DNA，广泛存在于包括血液在内的多种体液中，在肿瘤[1]、创伤[2]等病理情况下会升高。目前，国内外大多采用实时荧光定量PCR法检测血液cfDNA[3]，但外周血中cfDNA水平极低限制了其临床应用。Sytox green(S7020)荧光染料亲和力高，能特异性结合DNA，可极大提高检测的敏感性和特异性。骨科手术，如股骨、颈骨骨折手术后深静脉血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)发病率高，但早期诊断一直没有较好的指标，只能用影像学如超声、计算机断层扫描(CT)或造影予以明确诊断。cfDNA可诱导血小板聚集，促进凝血活化，抑制纤维蛋白溶解并直接干扰凝块的稳定性[4]。关于cfDNA与DVT关系的报道较少，有学者检测47例加压超声确诊DVT患者的cfDNA，发现其水平明显高于超声阴性患者和健康人对照组[5]。McIlroy等[6]用实时荧光定量PCR在创伤和创伤后手术患者的血标本中检测出异常表达的cfDNA。本研究用基于荧光染液Sytox green(S7020)特异性结合DNA的技术检测DVT患者血浆cfDNA水平，并探讨其作为DVT辅助诊断生物标志物的价值。

1 材料和方法

1.1 研究对象 2017年4月至8月北京积水潭医院因股骨骨折入院的患者，纳入标准：(1)年龄大于65岁；(2)股骨骨折。排除标准：(1)感染急性期，(2)合并肿瘤活动期、肝硬化、肾衰竭及免疫系统疾病且正在治疗中。共纳入研究对象106例，按加压双向超声标准[5]，分为骨折DVT组和骨折非DVT组，其中，骨折DVT组50例，男15例，女35例，年龄65～89岁，平均77岁；骨折非DVT组56例，男14例，女52例，年龄65～95岁，平均78岁，两组间年龄、性别比差异均无统计学意义(P均>0.05)。

1.2 标本采集与处理研究对象入院时采集肘静脉血3管，分别为无抗凝剂、EDTA-K2抗凝剂，0.109 mol/L枸橼酸钠(1∶9)抗凝剂管。将无抗凝剂管和枸橼酸钠抗凝剂管于室温下以1 500×g离心10 min，分别取上层血清和血浆；将分离的血浆于室温下以1 500×g离心10 min以获取乏血小板血浆，取上层血浆，-80 ℃保存。

1.3 主要仪器和试剂 XN-20全自动血液分析仪、 CS-5100全自动血凝分析仪及其配套WBC、PLT、D-二聚体(D-dimer，DD)试剂(日本希森美康公司)；Immage 800特定蛋白分析仪及其配套C反应蛋白(C-reactive protein，CRP)试剂(美国贝克曼库尔特公司)；TECAN infinite M200 pro多功能酶标仪(瑞士帝肯公司)；荧光染液Sytox Green(S7020) 购自美国Thermo fisher公司；DNA标准品及样品稀释液购自美国Sigma公司。

1.4 相关指标检测用XN-20全自动血液分析仪及其配套试剂检测EDTA-K2抗凝血WBC和PLT；用免疫比浊法检测血浆DD；用免疫比浊法检测血清CRP。实验室内质量控制均在控。

1.5 血浆cfDNA检测参照文献检测血浆cfDNA[7]。吸取20 μL待测血浆于1.5 μL离心管中，加入180 μL 1×buffer(货号F7171，Sigma公司)，混匀，取50 μL 稀释后样品，再加入50 μL 荧光染液Sytox Green(S7020)(终浓度2 μmol/L)，室温下避光放置5 min，用TECAN infinite M200 pro多功能酶标仪(激发光485 nm，发射光538 nm，震荡5 s)检测，其荧光强度与样品中DNA浓度成正比。每个样品设双孔(测试孔=稀释后血浆+染液，本底孔=稀释后血浆+稀释液)。用1 mg/mL DNA标准品(货号D4810，Sigma公司)分别配成终浓度为0、10、20、30、40、50、80、100 ng/mL的溶液，绘制标准曲线，以定量检测血浆中DNA浓度。分别收集20个健康人、20个血栓患者，分别制作混合乏血小板血浆，并检测批间CV<>CV<>

1.6 统计学分析用SPSS 21.0统计软件进行。正态分布的计量资料用表示，组间比较用两独立样本的t检验；偏态分布的计量资料用M(P25，P75)表示，组间比较用非参数秩和检验；用Spearman相关分析评估cfDNA与其他指标的相关性；用ROC曲线评估cfDNA诊断DVT的价值。以P<>

2 结果

2.1 骨折DVT组和骨折非DVT组的基本资料骨折DVT组的PLT、DD均高于骨折非DVT组(P均<>P均<>

表1 骨折DVT组和骨折非DVT组的基本资料

分组年龄(岁)CRP(mg/L)WBC(×109/L)PLT(×109/L)DD(mg/LFEU)骨折DVT组(n=50)76.9±7.923.05(14.69,70.85)6.78(5.53,7.63)270.5(198.75,326.00)7.81(5.01,10.95)骨折非DVT组(n=56)78.3±6.947.89(32.09,86.28)9.50(7.96,11.04)199.5(174.00,247.25)4.32(2.19,7.51)t/U0.93 945 491 861.5 785 P0.35 <0.01><0.01><0.01><0.01>

2.2 骨折DVT组和骨折非DVT组的血浆cfDNA水平骨折DVT组血浆cfDNA水平为337.38(272.89，436.42)ng/mL，高于骨折非DVT组232.56(208.54，280.89)ng/mL(U=483.0，P<>

2.3 血浆cfDNA与其他指标的相关性血浆cfDNA与PLT、DD呈正相关，与WBC呈负相关,相关系数(r)分别为0.273、0.365、-0.255，P均<>P均>0.05)。

2.4 血浆cfDNA和DD诊断骨折DVT的效能根据骨折DVT组和骨折非DVT组血浆cfDNA和DD水平制作ROC曲线，见图1，ROC曲线下面积(AUCROC)分别为0.825、0.733。约登指数(约登指数=敏感性+特异性-1)取最大值时，cfDNA和DD最佳诊断界值分别为287.86 ng/mL、3.4 mg/L FEU，敏感性分别为72.0%和96.0%、特异性分别为85.5%和43.6%，阳性预测值分别为81.8%和60.0%，阴性预测值分别为77.4%和92.3%，准确性分别为79.2%和67.9%。

图1 血浆cfDNA和DD诊断骨折DVT的ROC曲线

3 讨论

DVT易发部位为下肢深静脉，常见于骨科大手术后。血栓形成后，除少数能自行消融或局限于发生部位外，大部分会扩散至整个肢体的深静脉主干，若不能及时诊断和处理，多数会演变为血栓形成后遗症，长时间影响患者的生活质量；还有一些患者可能并发肺栓塞，造成非常严重的后果。因此，早期采取有效措施，预防术后DVT十分重要。DVT发生后DD有不同程度升高，血浆cfDNA是DD的良好补充。目前，血栓形成的诊断主要依赖超声，但超声不能动态观测血栓形成速率或提示血栓是否处于活动期。造影虽是诊断DVT的金标准，但有创和放射性限制了其使用频率和范围。

研究显示，多种疾病血浆cfDNA水平升高，因此，骨折后DVT的发生发展过程中可能也存在cfDNA水平的改变。目前，血液cfDNA的定量检测方法包括放射免疫法[8]、免疫荧光法、ELISA[9]、qPCR[10]等。现有技术提取的DNA水平和纯度达不到理想结果且费时，限制了cfDNA的临床应用。Sytox染液无需洗涤，避免了洗涤造成样品损耗。与Hoechst 系列[11](结合Minor Groove)和DAPI不一样，Sytox Green极少有碱基选择性。结合了核酸的Sytox Green荧光增强1 000倍，量子产率高。Sytox Green是一种极好的DNA染液，几乎不受血浆RNA干扰，以上特性使得Sytox Green染液成为一个简单、灵敏、一步定量DNA的指标。

本研究结果表明，骨折DVT组血浆cfDNA浓度升高，与骨折非DVT组比较差异有统计学意义(P<>[12]和Diaz等[5]报道基本相符。Fuchs等[12]用Sytox Green荧光染液检测cfDNA，其血栓组cfDNA水平均低于本研究，但结论相似：DVT患者血浆cfDNA升高。本研究结果显示，cfDNA水平与PLT、DD呈正相关，与WBC呈负相关。cfDNA水平升高，可能提示发生血栓风险。cfDNA的AUCROC 0.825，诊断效能优于DD。cfDNA特异性高于DD，敏感性低于DD，在辅助诊断DVT时，是DD的良好补充。

本研究显示cfDNA与DD呈正相关，也有研究报道血浆中cfDNA与血小板消耗和凝血相关，如血小板减少症[13]、FⅫ因子介导的内源性凝血与DIC预后不良[14]、DD[15]。动物实验表明，血栓时中性粒细胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps, NETs)形成与cfDNA升高具有一致性[16-17]。cfDNA提供血小板黏附支架，促使纤维蛋白沉积[18]，有助于血栓形成和稳定[19]。骨折可能激活了免疫细胞，释放核内物质[20]，这种核内物质是DNA与胞浆蛋白如组蛋白等形成的复合物[21]，组蛋白诱导血小板聚集和增强凝血酶生成[22]。鉴于上述分析，骨折可能引起血栓里有核细胞的释放，也可能是骨折的应激反应释放细胞因子[23]，激活免疫细胞释放核内物质。cfDNA也可能具有相似的出凝血效果，引发进一步高凝状态，一旦下一步手术，“二次打击”下可能有更多患者发生DVT事件。

4 参考文献

[1]Czeiger D, Shaked G, Eini H, et al. Measurement of circulating cell-free DNA levels by a new simple fluorescent test in patients with primary colorectal cancer[J]. Am J Clin Pathol, 2011,135(2):264-270.

[2]Lo YM, Rainer TH, Chan LY, et al. Plasma DNA as a prognostic marker in trauma patients[J]. 2000,46(3):319.

[3]Wang L, Xie L, Zhang Q, et al. Plasma nuclear and mitochondrial DNA levels in acute myocardial infarction patients[J]. Coron Artery Dis, 2015,26(4):296-300.

[4]Liaw PC, Ito T, Iba T, et al. DAMP and DIC: the role of extracellular DNA and DNA-binding proteins in the pathogenesis of DIC[J]. Blood Reviews, 2016, 30(4):257-261.

[5]Diaz JA, Fuchs TA, Jackson TO, et al. Plasma DNA is elevated in patients with deep vein thrombosis[J]. J Vasc Surg Venous Lymphat Disord, 2013, 1(4):341-348.

[6]McIlroy DJ, Jarnicki AG, Au GG, et al.Mitochondrial DNA neutrophil extracellular traps are formed after trauma and subsequent surgery[J]. J Crit Care, 2014,29(6):1131-1133.

[7]Abdol Razak N, Elaskalani O, Metharom P. Pancreatic cancer-induced neutrophil extracellular traps: a potential contributor to cancer-associated thrombosis[J]. Int J Mol Sci, 2017,18(3):E487.

[8]Lippmann ML, Morgan L, Fein A, et al. Plasma and serum concentrations of DNA in pulmonary thromboembolism[J]. Am Rev Respir Dis, 1982,125(4):416-419.

[9]Nymo SH, Ueland T, Askevold E, et al. Circulating nucleosomes in chronic heart failure[J]. Int J Cardiol, 2016, 203:742.

[10]Dhondup Y, Ueland T, Dahl CP, et al. Low circulating levels of mitochondrial and high levels of nuclear DNA predict mortality in chronic heart failure[J]. J Card Fail, 2016,22(10):823-828.

[11]Green M R, Sambrook J. Estimating the concentration of DNA by fluorometry using hoechst 33258[J]. Cold Spring Harb Protoc, 2017,2017(5):t93567.

[12]Fuchs TA, Brill A, Duerschmied D, et al. Extracellular DNA traps promote thrombosis[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010,107(36):15880-15885.

[13]Veneri D, Franchini M, Randon F, et al. Thrombocytopenias: a clinical point of view[J]. Blood Transfus, 2009,7(2):75-85.

[14]Park HS, Gu J, You HJ, et al. Factor ⅩⅡ-mediated contact activation related to poor prognosis in disseminated intravascular coagulation[J]. Thromb Res, 2015, 138:103-107.

[15]Faille D, Ajzenberg N, De CL, et al. OC-06 - Pro-thrombotic biomarkers in pancreatic diseases: are they specific of cancer? [J]. Thromb Res, 2016, 140(Suppl 1):S170-S171.

[16]Mozzini C, Garbin U, Fratta PA, et al. An exploratory look at NETosis in atherosclerosis[J]. Intern Emerg Med, 2017,12(1):13-22.

[17]Megens RT, Vijayan S, Lievens D, et al. Presence of luminal neutrophil extracellular traps in atherosclerosis[J]. Thromb Haemost, 2012,107(3):597-598.

[18]Savchenko AS, Martinod K, Seidman MA, et al. Neutrophil extracellular traps form predominantly during the organizing stage of human venous thromboembolism development[J]. J Thromb Haemost, 2014,12(6):860-870.

[19]Gould TJ, Vu TT, Stafford AR, et al. Cell-Free DNA modulates clot structure and impairs fibrinolysis in sepsis[J]. Arterioscler Thromb Vasc Biol, 2015, 35(12):2544.

[20]Martinod K, Demers M, Fuchs TA, et al. Neutrophil histone modification by peptidylarginine deiminase 4 is critical for deep vein thrombosis in mice[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013,110(21):8674-8679.

[21]Jorch SK, Kubes P. An emerging role for neutrophil extracellular traps in noninfectious disease[J]. Nat Med, 2017,23(3):279-287.

[22]Noubouossie DF, Whelihan MF, Yu YB, et al. In vitro activation of coagulation by human neutrophil DNA and histone proteins but not neutrophil extracellular traps[J]. Blood, 2017, 129(8):1021-1029.

[23]Foley JH, Walton BL, Aleman MM, et al. Complement activation in arterial and venous thrombosis is mediated by plasmin[J]. E Bio Medicine, 2016,5:175-182.

Auxiliary diagnostic value of plasma cell-free DNA in deep venous thrombosis formation in elderly patients with fractures

LIU Qiao1,2，WU Jun1

(1.Department of Clinical Laboratory，Beijing Jishuitan Hospital, Beijing 100035, 2．Department of Laboratory Medicine，Liyuan Hospital of Tongji Medical College of Huazhong University of Science and Technology，Wuhan 430076, Hubei, China)

Abstract: Objective To investigate the role of plasma cell-free DNA (cfDNA) for diagnosis of deep venous thrombosis formation (DVT) in elder patients with fractures. Methods According to the results of compression duplex ultrasound, 106 elderly patients with femoral fracture were divided into fracture with deep venous thrombosis (DVT) group (n=50, DVT group) and fracture without DVT group (n=50, non-DVT group). The concentrations of cfDNA in plasma were measured by fluorescence method. White blood cell count (WBC), platelet count (PLT), C-reactive protein (CRP) and D-dimer (DD) were simultaneously determined. Results The concentration of plasma cfDNA in DVT group was 337.38 (272.89, 436.42) ng/mL, which was significantly higher than that in the non-DVT group [232.56 (208.54, 280.89) ng/mL, P<0.01]. the="" levels="" of="" plt="" and="" dd="" in="" fracture="" dvt="" group="" were="" significantly="" higher="" than="" those="" in="" non-dvt="" group="" (all="">P<0.01). the="" levels="" of="" wbc="" and="" crp="" were="" lower="" than="" those="" in="" non-dvt="" group="" (all="">P<0.01). plasma="" cfdna="" level="" was="" positively="" correlated="" with="" plt="" and="" dd="" and="" negatively="" correlated="" with="" wbc,="" correlation="">r) is 0.273,0.365 and -0.255, respectively, all P<0.01. roc="" curves="" showed="" that="" the="" area="" under="" the="" curve="" cfdna="" and="" dd="" were="" 0.825="" and="" 0.733,="" and="" when="" cut-off="" value="" were="" 287.86="" ng/ml="" and="" 3.4="" mg/l="" feu(fibrinogen="" equivalent="" units),="" sensitivity="" were="" 72%="" and="" 96%="" while="" specificities="" were="" 85.5%="" and="" 43.6%.="">Conclusion The level of cfDNA in DVT patients is higher, and its clinical diagnostic efficiency is better than that of DD. It can be used as one of the biological indicators to assist the diagnosis of DVT.