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很多人做信号通路研究时，费了九牛二虎之力，好不容易找到了下游底物。满心欢喜地以为守得云开月明，岂料怎么也找不到可用的泛磷酸化抗体，下游的实验也难以开展。制备一个特异性的抗体呗，耗时耗力不说，好不好用还不知道。 有没有什么其他办法呢？其实市面上可供选择的泛磷酸化抗体很多很多，关键是你能不能找到其中适合你的那一款。 大部分蛋白激酶都有偏好的底物蛋白序列，例如 AMPK 偏好的序列是 LXRXXS*/T*，AKT 偏好的序列是 RXRXXS*/T*。检测以上两种蛋白激酶的底物磷酸化都有可用的商品化抗体。 如果你研究的蛋白激酶恰好既不是 AMPK 也不是 AKT，那该怎么办呢？ 办法还是有的。下面就以当前研究得如火如荼的蛋白激酶 mTORC1 为例。 mTORC1 是一类丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶复合物，在细胞增殖、细胞代谢和细胞自噬等生物学过程中发挥重要的调控作用。 关于 mTORC1 的研究虽然火热，但目前市面上并没有可用的针对其底物的泛磷酸化抗体。好在 mTORC1 偏好的底物蛋白序列已经由 David Sabatini 实验室在 2011 年的一篇《Science》论文中予以揭示。 David Sabatini 指出，mTORC1 底物的磷酸化位点 1 位的氨基酸一般倾向于含有苯环结构的氨基酸。如上图所示，F（苯丙氨酸）、P （脯氨酸）、W （色氨酸）、Y （酪氨酸）和 V （缬氨酸）都含有苯环或者类似的结构。 下边就好办了，根据你的底物蛋白序列，选择合适的泛磷酸化抗体就可以了。 以笔者研究的一类 mTORC1 蛋白底物为例。我研究的底物蛋白含有 1 位为 P 的蛋白序列，我选择的就是识别 S*/T*P 的泛磷酸化抗体 （在这之前，我也是像无头苍蝇一样尝试了近十种不同公司的泛磷酸化抗体，基本都不好用，说出来都是泪啊）。 我们可以看到，用识别 S*/T*P 的泛磷酸化抗体可以很好的地检测到底物蛋白的磷酸化，而用没有特定序列识别特性的泛磷酸化抗体几乎检测不到底物蛋白的磷酸化 （哪个公司的产品就不说了哈）。 即使是特定的磷酸化蛋白序列，如 S*/T*P，含有该序列的蛋白也是成百上千，为了尽可能地降低其他蛋白的影响，同时增强目的蛋白的信号。一般用这样的泛磷酸化抗体进行检测之前，需要通过免疫共沉淀将目的蛋白富集提纯。 当然，你如果利用纯化的蛋白激酶和纯化的底物蛋白，进行体外蛋白磷酸化实验 （in vitro kinase assay），就省掉了富集提纯目的蛋白这一步。 除了富集提出目的蛋白，检测蛋白磷酸化的一般注意事项也不能省，例如蛋白质裂解液中需要加入磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂等等。 ● 总结一下 首先，了解你研究的蛋白激酶偏好的蛋白序列；然后，看看你的目的蛋白是否有这样的序列 （如能通过质谱鉴定等确定则更靠谱）；最后，搜集市面上符合你的条件的抗体开始实验吧。 |
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