林圣彩教授点解 “贫穷基因” 的前世今生

摘   要

从 “2018 冷泉港亚洲：癌症与代谢” 会议林圣彩教授主题报告的演讲内容出发，深度整理林教授 AMPK 系列研究重大成果和新发现的研究思路，以期帮助科研工作者能够借助他山之石，在自己的领域巧耕耘，摘硕果。

图 1：林圣彩 教授 冷泉港 2018 报告现场

3 月 26 日（本周一）晚，在 “2018 冷泉港亚洲：癌症与代谢” 会议的主题报告上林圣彩教授带来了 AMPK 最新的研究成果。林教授系统的介绍了 AMPK 作为糖感受器这一改写教科书式发现的研究历程。其通路逐步阐明的故事也为广大科研工作者提供了很好的参照。

作为林教授的 “粉丝”，此次有幸在现场听到了林教授风趣的演讲和研究历程的故事，小编将林教授的分享再结合其科学发现和研究思路整理如下，希望能给大家带来一点启发。一隅之见，如有谬误，望不吝赐教。

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研究战略：围点打援，深挖洞，广积粮

近 20 年来 [1]，林教授课题组一直都在持续关注 Axin 蛋白相关分子及其作用机制。

Axin 是多结构域支架蛋白，能与 APC、GSK-3β、PPA2 和 β-catenin 等蛋白相互作用形成复合物，是 Wnt 信号通路中的关键负调控因子。

林教授课题组早年就发现除了在 Wnt 信号通路的经典作用，Axin 作为支架蛋白在 JNK 信号通路中也起到了多重作用 [2]。从相互作用蛋白入手阐明了整个信号通路的分子机理及生物学功能。此后又进一步研究 Axin 同 p53 的关系与作用 [3-4]，及其在 TGFβ 信号通路中的功能和机制 [5]。将 Axin 的生物学意义在发育分化、细胞生长、凋亡、肿瘤研究领域进行了深入挖掘，产生了系列研究成果。

随后林教授课题组又逐渐将研究的目光转向细胞代谢相关的信号通路，并在 AMPK 的研究中取得了修改经典教科书级别的发现。林教授在同一个蛋白上深度挖掘，从一条通路扩展到相关的多条信号通路，进而又涉及到了不同学科领域，阐述跟同一个蛋白相关的其他通路的功能新发现，并能够持续的高水平产出。这除了需要能够洞见 Axin 这样蛋白的多通路桥梁作用的战略眼光之外，还需要课题组有成熟完备的技术平台和辛勤努力的科研人员。

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如何修炼自己的战略眼光？首先需要对经典通路的关键节点及其上下游有充分的理解，CST 通路帮您搭建信号通路、蛋白相互作用的既微小又宏大的世界观：

图 2：经典的 WNT 信号通路中 Axin 起到关键调节作用，点击👆图片查看 Axin 相关的更多经典信号通路：MAPK、JNK、AMPK、Warburg、凋亡（Apoptosis）等。

2

“跨界分子” AXIN 的再次升华：在 AMPK-LKB1 互作机制中的功能，明确其代谢通路地位

作为细胞能量感受器，AMPK 可对 AMP：ATP 比值升高做出反应。在其激活后，可对补充细胞 ATP 供应的信号转导通路做出正向调控，这些通路包括脂肪酸氧化和自噬。AMPK 对消耗 ATP 的生物合成过程具有负向调控作用，包括糖异生、脂质和蛋白质合成。林教授风趣而又贴切的将 AMPK 比喻为细胞感知 “贫穷” 状态的关键蛋白。

AMPK 作为异源三聚体复合体出现，内含一个催化性 α 亚单位和调节性 β 和 γ 亚单位。AMP 结合到 γ 亚单位后，可变构激活复合体，使其变为苏氨酸 172 （T172）位点更易磷酸化的底物，在 α 亚单位的激活环中更易被主要的上游 AMPK 激酶 LKB1 磷酸化。因此 pAMPKα （T172）被 LKB1 磷酸化被看做是 AMPK 通路激活的标志。

从 2013 年的 Cell Metab 文章开始 [6]，林教授课题组开始将 AXIN 的研究拓展到了 AMPK 信号通路，首次报道发现了 AXIN-AMPK-LKB1 复合物相互作用的现象，确立 AXIN 在 AMPK 通路中的作用。其研究思路简单总结如下（详细请见文末参考文献原文）：

Figure 1, 2 多模型现象阐述：AXIN 对 AMPK 激活和脂质稳态调节起到关键作用。

• 方法：小鼠及不同细胞模型中（包括禁食和葡萄糖饥饿），siAXIN 后检测不同状态下的 AMPK 激活情况，及成脂代谢指标。

• 所用技术：WB、生化检测、mRNA 检测、IF、成脂染色、siRNA。

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检测指标的筛选在表型研究中至关重要，CST 推出了很多小包装抗体试剂盒，帮助大家多快好省初筛通路蛋白，以本文涉及到的 AMPK 相关的脂代谢领域为例：

货号	名称	包含靶点
9957	AMPK and ACC Antibody  Sampler Kit	pAMPKα (T172), AMPKα,  pAMPKβ1 (S182), AMPKβ1/2, pACC (S79), ACC
9839	AMPK Subunit Antibody  Sampler Kit	AMPKα1, AMPKα2, AMPKβ1, AMPKβ2,  AMPKγ1, AMPKγ2, AMPKγ3
8660	PPARγ Regulated Fatty Acid  Metabolism Antibody Sampler Kit	pAMPKα (T172), AMPKα, CBP,  GCN5L2, PPARγ, SirT1, RXRα
8335	Fatty Acid and Lipid  Metabolism Antibody Sampler Kit	AceCS1, pACC (S79), ACC,  ACL, pACL (S455), FAS, Lipin 1, ACSL1
12589	Adipogenesis Marker  Antibody Sampler Kit	ACC, Adiponectin, C/EBPα,  FABP4, FAS, Perilipin, PPARγ
8334	Lipolysis Activation  Antibody Sampler Kit	HSL, pHSL (S563), pHSL  (S565), pHSL (S660), Perilipin
12704	Acetyl-CoA Carboxylase 1  and 2 Antibody Sampler Kit	pACC (S79), ACC, ACC1,  ACC2

表：CST 的 AMPK 相关的脂代谢领域小包装抗体试剂盒。点击查看用于靶点筛选的小包装抗体试剂盒。

Figure 3 机制说明：AXIN-AMPK-LKB1 复合物证明。

• 所用技术：coIP、Pulldown、WB、IF。

Figure 4 深入机制：AMP 增加 AMPK-AXIN 亲和力。

• 方法：外源 AMP、ADP、ATP 等刺激；AMPK 激动剂处理；及过表达、点突变等不同情况下 IP-WB 看结合能力变化。

• 所用技术：coIP、Pulldown。

Figure 5 找到突破点，夯实机制：AMPK 的豆蔻酰化对 AMPK-AXIN 亲和力增加是必须的。

• 方法：结合重组表达、点突变、AMP 梯度处理、关键结合结构域的缺失突变等不同的方法测试验证 AMPK-AXIN 亲和力的影响因素。

• 所用技术：coIP、Pulldown、重组表达。

Figure 6 探索上游因素，解释现象：AXIN 影响 AMPK 是通过 LKB1 进行的。

• 方法：将 LKB1 纳入上述实验的分析体系。

所用技术：coIP、Pulldown、siRNA。

图 3：AXIN-AMPK-LKB1 相互作用现象阐述和机制证明，及作用模式图 [6]。

此文证明了 AXIN 是一个桥梁，不仅在经典的 Wnt 通路中起作用，而且也 “意外发现” 其将 AMPK 和其上游激酶 LKB1 连接在一起 [7]。此三者形成一个复合体，促进 LKB1 对 AMPK 的磷酸化激活，使得 AMPK 的活性升高，从而完成信号传递过程。当时这篇文章认为 AMP 在其中起到最关键的作用，而尚未明确此文中采取的糖饥饿这种刺激因素实际上也能成为 AMPK 还是糖感受器的一个证据，也为后面更升华的研究埋下伏笔。

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“顺藤摸瓜” 发现 v-ATPase - Ragulator 复合物是代谢控制的中心：可调节 mTORC 和 AMPK 的开关

AMPK 之外，mTOR 也是细胞代谢通路的一条主要通路。mTORC1 是重要的生长调节因子，能够控制调节脂质合成代谢、增殖、蛋白翻译合成等一系列合成代谢途径。相对 “贫穷” 感知者：分解代谢通路的 AMPK，林教授将合成代谢通路的 mTOR 比喻为细胞感知 “富足” 状态的关键分子。

小分子 GTP 酶 Rheb，在与 GTP 结合的状态下，是 mTORC1 激酶活性所需的强效刺激剂，并且受到其 GAP（即TSC1/2）的负性调控。在经典通路中，绝大多数上游输入信号通过 Akt 和 TSC1/2 来调节 Rheb 的核苷酸负载状态，AMPK 对 mTORC1 的负调控也不例外。

与这种通过 “PI3K/Akt – TSC 复合物- Rheb” 轴的中心调控方式相对应的，氨基酸信号以独立于轴的方式将信号指向 mTORC1 ，并促进 mTORC1 转运到溶酶体表面，在溶酶体可与 Rheb 接触并激活。这一过程由多种复合体的协调行动来介导，主要包括 v-ATPase – Ragulator - Rag。 Rag 是一类 GTPase，由 A、B、C、D 四个成员组成，Rag A/B 的 GTP 结合形式能将 mTORC1 转位到内涵体表面。Ragulator 复合物是由 LAMTOR 1/2/3/4/5 组成的五聚物，能将 Rag 定位到内涵体膜，并且可以作为其鸟苷酸交换因子（GEF）。V-ATPase 能够感受能量和营养状态，刺激 Ragulator 的 GEF 活性，进而使得 Rag A/B 由 GDP 结合形式转化为 GTP 结合形式，从而增加 Rag 同 mTORC1 的亲和力，最终导致 mTORC1 转位到溶酶体表面 [8]。

图 4：经典的 mTOR 信号通路。点击查看 mTOR 信号通路的简介和热门靶点抗体产品。

那么，在经典的 “TSC 复合物- Rheb” 轴之外，是否还存在 AMPK 对 mTOR 调控的另外作用机制？在不同能量和营养状态下这两条经典的通路如何对话？林教授课题组 2014 年发表的论文给出了证明：溶酶体 v-ATPase - Ragulator 复合物是 AMPK 和 mTORC1 的共同激活因子，是合成代谢和分解代谢的重要开关 [8]。其研究思路简单总结如下（详细请见文末参考文献原文）：

Figure 1 明确第一主角和前文关联： LAMTOR1 在 AXIN 激活 AMPK 作用中是必须的。

• 方法：用 siAXIN 证明 LAMTOR1 和 AXIN 有互作；肝脏特异性敲除、肌肉特异性敲除 LAMTOR1 小鼠中，检测 AMPK 活性和下游功能；LAMTOR1 敲除原代细胞或 RNAi 模型中检测 AMPK 在糖饥饿、不同激动剂下的作用。

• 所用技术：coIP，WB、生化检测、siRNA。

Figure 2 第一主角调控细节阐明：葡萄糖饥饿介导 Ragulator-AXIN/LKB1-AMPK 复合物在内涵体形成。

• 方法：细胞和动物模型中，结合条件性敲除，siRNA 证明蛋白互作和共定位。找到点突变，补充证明互作重要性。找到干预晚期内涵体的指标，进一步证明内涵体定位的重要性。

• 所用技术：coIP、Pulldown、WB、密度梯度分离、IF、siRNA、激酶活性检测。

Figure 3 做实调控功能，确实是全新发现的通路：LAMTOR1 降低 pAMPK 激活所需的 AMP 浓度阈值。

• 方法：LAMTOR1 敲除模型中检测 AMP 不同浓度作用下的 AMPK 激活。关键活性位点的点突变、激活剂、通路上下游检测等方法，排除经典作用通路，说明 LAMTOR 对 AMPK 的激活为全新通路。

• 所用技术：WB、点突变。 

Figure 4 进一步链接框架，印证新颖性：AXIN 在 LKB1 转位至内涵体过程中起到支架蛋白的作用。

• 方法：敲低 AXIN 的情况下做 LAMTOR1 和 AMPK、mTORC1 复合物的互作、共定位。梯度离心印证细胞亚定位。并排除 AMPKa 自身及 TSC 复合物经典通路在定位和互作中的主要作用，进一步印证本研究的新颖性。

• 所用技术：coIP、IF、WB、密度梯度分离。

Figure 5 再点出第二主角：v-ATPase 和 Ragulator 共同扮演主要感受器促使 AXIN/LKB1 的转位

• 方法：将 v-ATPase 拉入互作证明体系。配合体外结合、激动剂处理实验验证。

• 所用技术：coIP、IF、WB、密度梯度分离、siRNA。

Figure 6 第二主角的功能和机制再明确：AXIN 在 v-ATPase 抑制导致的 mTOR 从内涵体解离中起到协助作用

• 方法：敲低 AXIN、敲低 AMPK、突变 AXIN 上 LAMTOR 结合位点等的情况下做 AMPK、mTORC1 复合物、vATPase 互作和功能改变。

• 所用技术：coIP、IF、WB、密度梯度分离。

Figure 7 链接到经典通路的功能中，完善整体机制： AXIN 抑制 Ragulator 对Rags 的 GEF 活性，补上机制作用链条的最后一环节

• 方法：敲低 AXIN、缺失突变 AXIN、敲低 LAMTOR1 的情况下看复合物成分的变化。并检测 GTP 结合形式 Rag 的变化，证明 AXIN 对 mTORC1 转位激活复合物的抑制作用机制。

• 所用技术：WB、coIP、Pulldown、GEF 活性检测。

图5：溶酶体 v-ATPase- Ragulator 复合物是 AMPK 和 mTORC1 的共同激活因子，是合成代谢和分解代谢的重要开关机制证明，及作用模式图 [8]。

此研究的重要意义在于经典的两大细胞代谢通路由于 AXIN - V-ATPase– Ragulator-Rag 互作复合物的存在，在溶酶体上关联到了一起。发现了一条区别于经典 AMPK-mTOR 调控模式的新途径。以 mTOR 为代表的合成代谢途径和以 AMPK 为代表的分解代谢途径，实际上有着之前为人不知的更广泛的联系和密切相互作用 [7]。这也为代谢稳态的分子机制探索和相关药物作用机理的发现和开发提供了重大依据。

“万能神药” 二甲双胍作用机制的揭示就提供了一个有力证明。林教授课题组的进一步研究还发现了二甲双胍能通过 V-ATPase – Ragulator，作用于 AXIN-LKB1，最终激活 AMPK 并抑制 mTORC，为揭示经典药物的药理机制提供了重要参考 [9]。

4

打通 “任督二脉”：AMPK 感知葡萄糖的全新方式被发现

在发现了 AXIN 能在 AMPK 通路中起作用，并且接着又证明 AMPK 和 mTOR 两条通路焦点控制开关的 V-ATPase – Ragulator 之后。上面实验的处理组：葡萄糖饥饿和 AMP 处理激活同时采用，似乎总是会引发一个问题：葡萄糖剥夺激活 AMPK，是否仅通过 AMP 的变化发生？

于是林教授课题组又做了大量工作，发现 AMPK 对于葡萄糖的感知是通过前所未知的途径进行的：果糖 1,6-二磷酸（FBP）和醛缩酶（ALDO）可以介导AMPK 感知葡萄糖 [10]。其研究思路简单总结如下（详细请见文末参考文献原文）：

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本文涉及的糖酵解过程中间化合物和酶较多，可以利用通路图帮助回忆这些分子的关系。

图 6：经典的 Warburg 效应信号通路，展现糖酵解关键节点。点击查看 Warburg 效应信号通路的简介和热门靶点抗体产品。

Figure 1 现象阐述，揭示新机制：葡萄糖饥饿激活 AMPK 不依赖于 AMP/ADP

• 方法：葡萄糖梯度下 AMPK 活性变化，和 AMP/ADP 的比值变化。糖和氨基酸缺失培养基作用不同时间下的 AMPK 活性变化。及伴随的 AMP/ADP 比值变化。

• 所用技术：激酶活性检测、LC-MS。

Figure 2 做实表型的新通路：葡萄糖饥饿激活 AMPK 依赖于溶酶体途径，排除能量应激效应

• 方法：糖和氨基酸缺失培养基作用不同时间下的 AMPK 的活性变化时， AMPK 相关蛋白的激活情况。点突变关键蛋白 AMPKβ2 的关键点 G2A，证实豆蔻酰化相关的溶酶体机制的关键作用。并排除通过其他途径的信号传递可能性。

• 所用技术：激酶活性检测、WB、点突变、CRISPR-Cas9。

Figure 3 筛到关键代谢物：FBP 缺失是饥饿激活 AMPK 的关键代谢物信号

• 方法：上游 HK 酶 RNAi 之后的检查糖刺激下的 AMPK 通路。并利用体外重构体系的对比操控，筛查验证关键化合物节点。然后再利用不同细胞模型直接验证。

• 所用技术：siRNA、coIP、WB。

Figure 4 找到与关键代谢物互作的关键酶，补全机制：ALDO 是 FBP 作用于葡萄糖饥饿激活 AMPK 信号的物理连接点

• 方法： ALDO-TKD（A，B，C 三者同时敲除）后 AMPK 的激活情况检查。合并 AXIN 敲除。点突变 ALDOA 后检查证明关键结合位点情况。

• 所用技术：siRNA、coIP、WB、Pulldown。

图 7：果糖 1,6-二磷酸（FBP）和醛缩酶（ALDO）可以介导 AMPK 感知葡萄糖，及作用模式图 [10]。

 

虽然这里只按照论文的正图主线讲解了行文的逻辑，但是背后大量的工作和严谨的论证，让我充分信服 AMPK 作为糖感受器的坚实分子基础。这篇文章颠覆了传统认为的：AMPK 需要依赖于 AMP 结合才能活化的认知。研究也开创了醛缩酶以及糖酵途径成为 AMPK 调节新途径，以及 AMPK 可以作为糖感受器调控代谢过程的新认知 [10]。

文章还侧面印证了 AMPK 作为能量感受器和糖感受器的双重功能。这也是在急性葡萄糖饥饿期间，细胞 AMP：ATP 能量供给能维持不变现象的分子基础。首先 AMPK 作为葡萄糖传感器，其次作为监测能量状态 AMP：ATP 的传感器。AMPK 的双重功能能够独立运作，也会彼此增强 [11]。这种能量和糖的稳定对于细胞正常的生理功能稳态的维持起到重要作用。