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作者：WEE
来源：科研小助手公众号
实时荧光QPCR是当今世界用于临床的最先进核酸分子诊断技术，被美国FDA承认并推崇，被美国FDA批准并取得临床应用执照的QPCR试剂品种有：乙肝病毒（HBV），丙肝病毒（HCV），艾滋病病毒（HIV），沙眼衣原体Chlamydi trachomatis（CT），性传播疾病，淋病双球菌Neiserria gonorrhea(NG)，巨细胞病毒Cytomegalovirus（CMV），呼吸道疾病，结核分支杆菌Mybobacterium tuberculosis（Mtb）等。【百度百科】
而引物设计的好坏绝壁会是你qPCR中最为关键的一步，所以今天小编就给大家带来了一些干货~大家有任何好的方法也欢迎再留言区留言哦~ 如果你问实验室的小伙伴们，怎么设计qPCR引物啊？
1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5'端的300-400bp区域内，可以用DNAMAN，primer5软件看看结果。
2、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。
3、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。
4、碱基要随机分布，尽量均匀。
5、引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。不能形成2级结构。
6、引物5‘端可以修饰。3’端不可修饰，而且要避开AT，GC rich的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。引物3'端要避开密码子的第三位。
7、引物扩增的产物最好鞥能够横跨一个内含子，这样可以避免基因组DNA的污染。
8、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。
于是你熟读上述原则，屁颠屁颠感激涕零的花了一下午终于设计完了一对引物，跑去跟师妹炫耀，结果师妹带着同情可悲的复杂眼神看了你一下，悠悠说了一句：我5秒钟就可以设计好了！ What？！5秒？！你是凯丁吗！？我猜当时你的心情肯定是这样的： 
下面就让小编以鼠的GAPDH为例教大家如何5秒设计完引物。
首先打开PrimerBank：https://pga.mgh./primerbank/。记不住网址的请自行问度娘。打开之后如下图： 
在Search by选项中有五个选项： 
小编建议各位选择NCBI Gene ID选项，当然你也可以选择其他选项，但是有可能无法搜出你想要的东西来，比如你选择了Keyword或者NCBI Gene Symbol选项，当你输入PD-1是无法搜索到的，你必须输入PDCD1，再比如PD-L1，你必须输入CD274才可以，所以比较麻烦。 那问题来了，Gene ID是什么鬼？ 请打开NCBI，选择Gene选项，输入你需要搜索的基因，如GAPDH，出现下图： 
看见没，第二个就是我们要找的GAPDH，下面小小的ID: 14433就是Gene ID，你可以点开，看到下图： 
好了，Gene ID拿到了，在For text一栏输入14433，点击submit。
好了，见证奇迹的时刻！科研小助手：SciRes 
一共有4对引物，如果出现如Primer Pair 4一样下方有绿色标记条的，那么恭喜你！这对引物是验证过的！
看，小编是不是没有骗你！1秒打开PrimerBank，1秒选择好选项并输入ID点击submit，心里默数“1、2、3见证奇迹的时刻！”是不是5秒引物就设计好了。5秒设计不好那是你网速不行！
现在PrimerBank包含306,800对人和鼠的qPCR引物，而其中鼠的26,855对已经验证过！
“ 有小伙伴说“不要问我为什么！我就是这么悲催！这三十多万对引物中就是没有我要的基因引物！小编救我！”好吧，自己动手丰衣足食！小编再传授这些悲催的孩子一个差不多5秒也能搞定的方法！
首先还是打开primer3的网址：http://primer3./。科研小助手：SciRes 
选择你要设计的基因的物种，此处以PD1为例，所以选择HUMAN，中间空白处粘贴PD1的CDS序列，点击左下角Pick Primers！好了，等待吧~ 注：基本该页面的参数都不用修改，如果你非要修改也只能是这边了： 
几秒之后结果就出来了，一共也是四对引物： 
看看相中哪个就拿哪个来做实验吧~
你问我如何得到基因的CDS~o(╯□╰)o~，同学，你是有多白？那就跟着小编做吧。 首先打开NCBI，选择Nucleotide选项，输入PDCD1，打开你要的mRNA序列，下拉到CDS区域，点击CDS。 
然后点击右下角FASTA。
复制下面的序列就是PDCD1的CDS区域了。
是不是有小伙伴此时已经窃喜，“唉，难道真的要告别单身了么？这真的是一个装逼撩妹好技能啊~”。
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