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一顿操作猛如虎，一看战绩0-5。 尽管引物设计是PCR实验成功的前提，但是蛮多小伙伴的实战经验稍显不足。 今儿就向大家介绍2种引物设计方法。 This is the dividing line. 引 物 设 计 尽管是老生常谈了，但是小编还是想先把引物设计的原则放出来(其实是复制粘贴啦，哪哪都有)。 1、引物应用核酸系列保守区设计并具有特异性。最好位于编码区5\'端的300-400bp区域内，可以用DNAMAN，Alignment软件看看结果。 2、不能形成2级结构。 3、引物长度一般在17-25bp之间，上下游引物不能相差太大。 4、G+C含量在40-60%之间，45-55%最佳。 5、碱基要随机分布，尽量均匀。 6、引物自身不能有连续4个碱基的互补。 7、引物之间不能有连续4个碱基的互补。 8、引物5‘端可以修饰。 9、3’端不可修饰，而且要避开AT，GC富集的区域，避开T/C,A/G连续结构（2-3个）。 10、引物3\'端要避开密码子的第三位。 11、引物整体设计自由能分布5\'端大于3‘端。 12、定量产物长度80-150bp最好，最长是300bp。 原则忒多啦，小伙伴们，先别晕，看下方。 方法一：PrimerBank法 网址： https://pga.mgh./primerbank/index.html 打开以上网址，进入PrimerBank网站界面，如下图 个人觉得这是最便捷的引物获取方法，该网站可以非常迅速地检索到已经他人验证的引物序列及相关反应条件。 图中第一个方框，一般选择NCBI Gene ID；第二个方框选择你所关注的物种，常用的就是Mouse和Human了，如果为其它物种，则选择All Species即可；第三个方框中需要输入你关注的基因ID号码。 如何获取基因ID呢，这里就需要打开NCBI网站，选择Gene，并输入你的目的基因如p53 homo，选择第一个，可见其ID号为7157。如下图所示。 然后将ID号7157输入上方PrimerBank网站的For text框中，并选择种属为人，点击Submit后，跳转页面如下。 网站会自动推荐3对已经验证的引物，小伙伴们可以直接拿着用了。 方法二：Ensembl+NCBI BLAST法 很多人会推荐大家使用Oligo、PP或DNA man之类的，小编这里想推荐一个更好用的网站，Ensembl，非常实用。 网址1： http://asia./index.html 网址2： https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/index.cgi?LINK_LOC=BlastHome 首先打开Ensembl网站，选择物种为Human，检索基因为BRCA2（其它物种可在左下方箭头处寻找）。如下图所示。 顺手点击Go，跳转至以下界面。由于我们要拿到转录组的序列，所以需要进一步点击左侧的Transcript筛选框。 点击转录组筛选框后，可见以下界面，我们可以选择第一个。 继续点进去，然后在左侧选择cDNA，点击后如下图所示。 |
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