荧光定量PCR引物设计

Primer Design

qPCR是分子诊断学最常用的一种方法，今天小编就尝试对引物设计方面进行整理，希望让qPCR实验不再是烦恼。

01

引物设计原则

1. 引物长度：18-30bp；

2. GC含量：30%-80%，最好是 40%-60%之间；

3. 引物Tm值最好在 60℃左右，上下游的两条引物Tm差异不要超过4℃；

4. 避免引物与目的基因之间发生错配，特别是引物3'端；

5. 避免特定碱基的连续重复，特别是引物 3’端出现3个或以上连续的C或者G碱基重复;

6. 避免引物自身形成发夹结构；

7. 避免引物之间形成二聚体，特别是引物3'端；引物自身不能有连续 4 个碱基的互补；

8. 引物设计跨内含子，这里上下游引物可以在不同的外显子，或者同一个引物刚好跨两个外显子；

9. 引物 5′ 端可以修饰，引物 3′ 端不可修饰；

10. 引物特异性比对：NCBI primer-blast；

02

扩展产物大小

1. 产物大小一般控制在80-300bp，150bp最适长度，相对短的扩增产物，扩增效率会要高；

2. 产物GC含量在40%-60%；

03

验证

数据库参考：

1. NCBI Refseq（NCBI Reference Sequence）数据库中基因类型为lncRNA，pseudo的全部基因；

2. mirbase数据库中human，mouse，rat全部成熟体序列的microRNA；

3. circbase数据库中human，mouse全部circRNA；

坚持的三个最重要设计原则

1. 引物跨内含子设计，避免基因组污染带来的影响；

2. 引物在基因（NCBI Refseq）对应的所有转录本同源区设计；

3. 引物特异性，设计引物全部使用NCBI primer-blast比对工具进行引物特异性比对；

END