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如何快准狠设计PCR引物

2018-03-13  山峰云绕

如何快准狠设计PCR引物


            【【医学方】如何快准狠设计PCR引物】http://toutiao.com/group/6514827267745513998/?iid=15906422033&app=explore_article&timestamp=1520870806&tt_from=copy_link&utm_source=copy_link&utm_medium=toutiao_ios&utm_campaign=client_share


首先介绍一下荧光定量PCR引物设计原则:

1、引物长度一般在15-30bp。常用的为18-27bp,但不应大于38bp,因为过长会导致其延伸温度大于74℃,不适于Taq DNA聚合酶进行反应;

2、引物GC含量一般为40%-60%,45-55%为宜,GC含量过高或过低都不利于引发反应。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近;

3、引物所对应的模板序列的Tm值最好在72左右。至少要在55-80℃之间。

4、引物3’端的碱基一般不用A。A在错误引发位点的引发效率相对比较高。引物3’端出现3个以上的连续碱基,如GGG或CCC,或者引物3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

5、碱基要随机分布,且引物自身和引物之间不能有连续4个碱基的互补。

6、尽量在Exon junction上设计引物,限制基因组DNA扩增。

7、使用BLAST检索,确认引物特异性。

下面推荐Primer-BLAST在线引物设计网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/,这个网站可以在线设计用于聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物,同时整合了Primer3和NCBI的Blast功能。那么如何使用Primer-BLAST呢?

1. 假设我们要设计human p53引物,登陆PubMed https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed,选择Nucleotide, 输入p53 human mRNA(基因+物种+mRNA),单击Search。

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左侧选择mRNA,出现的第一条就是human mRNA的序列,点击进入。

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选择FASTA格式,点击进入。

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你就可以得到Human p53的mRNA序列。我们可以直接单击右侧的Pick primer。

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2.直接跳到NCBI的Primer-BLAST页面,提交的界面主要包括四个部分:PCR template(模板区), Primer Parameters(引物参数区), 和Exon/intron selection(外显子内含子选择区),Primer Pair Specificity Checking Parameters(验证引物特异性)。

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在PCR Template下方文本框中我们也输入FASTA格式的序列或Accession Number,或点击“选择文件”载入FASTA格式的文件。右侧可以设置正向引物和反向引物的起始和终止位置。在“Primer Parameters”模块,可以输入PCR产物的大小(PCR product size)和Tm值参数。如何你已经设计好了引物,要拿来验证引物的好坏,可以在此输入。一般产物短设为大小最小值50,最大值设为300。引物Tm温度接近,设置差2℃。

选择引物设计跨越内含子,限制基因组DNA扩增。

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3.Primer Pair Specificity Checking Parameters验证引物的特异性,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这里提供了6种数据库:RefSeq mRNA, Refseq representative genomes,nr,RefseqRNA(refseq_rna),Genomes for selected organism, Custom。推荐使用“Refseq representative genomes”数据库,Custom可以使用自己的序列作为搜索数据库。

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用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时,Primer-BLAST可设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advanced parameters”有更多参数设置,但一般不用再增加参数设置了。

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4.单击Get primers,有时可能需要耐心等待一会,

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出现结果界面,下图是引物的可视化结果,该结果会显示出所有引物的起始和终止位置,基因的CDS区,外显子的位置等。

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以及会给出每一个引物对的具体信息,包括引物序列,长度,起始终止位置,Tm值,GC含量,自身互补和3’端互补情况,PCR产物的长度和位置等。其中,Self complementarity和Self 3' complementarity的值越小越好。

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根据小编最开始总结的引物设计原则,从出现的引物选择里,第三条引物我们可以使用,把序列复制下来发给引物合成公司就可以啦。

当然引物设计也可以使用其他很多在线网站,例如Primerbank等,小编还是喜欢用NCBI,或者直接从文章Method里寻找粘贴到NCBI这个primer design tool对引物进行评价。今天又和小编学习如何快准狠设计荧光定量PCR引物,是不是很简单呢?


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