Primer-BLAST,在线设计用于聚合酶链反应(PCR)的特异性寡核苷酸引物。Primer-BLAST可以直接从Blast主页(http://blast.ncbi.nlm./)找到,或是直接用下面的链接进入: 这个工具整合了目前流行的Primer3软件,再加上NCBI的 Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤,设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验 证。并且,Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物–an important feature for PCR protocols measuring tissue specific expression(注:没办法准确的翻译,只好作罢,汗!)。Primer-BLAST有许多改进的功能,这样在选择引物方面比单个的用 Primer3和NCBI BLAST更加准确。 Primer-BLAST的输入Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括三个部分:target template(模板区), the primers(引物区), 和specificity check(特异性验证区)。跟其它的BLAST一样,点击底部的“Advanced parameters”有更多的参数设置。 模板(Template)在“PCR Template”下面的文本框,输入目标模板的序列,FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列,是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物,并且在目标数据库(在specificity check区选择)是唯一的。 引物(Primers)如果你已经设计好了引物,要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库(在specificity check区选择)。根据需要可设置产物的大小,Tm值等。 特异性(Specificity)在specificity check区,选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了4种数据库:RefSeq mRNA, Genome (selected reference assemblies), Genome (all chromosomes), and nr (the standard non-redundant database)。前两个数据库是经过专家注释的数据,这样可以给出更准确的结果。特别是,当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准 来设计引物时,Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。selected reference assemblies 包括以下的物种: human, chimpanzee, mouse, rat, cow, dog, chicken, zebrafish, fruit fly, honeybee, Arabidopsis, 和 rice。Nr数据库覆盖NCBI所有的物种。 实例分析用人尿嘧啶DNA糖基化酶(uracil-DNA glycosylase genes, UNG, GeneID: 7374)的两个转录本序列作为一个例子来分析。UNG1的序列长一点(NM_003362),UNG2的序列短一点(NM_080911,注:拿这两个 基因的序列ClustalW一 下就可以了)。这里用UNG2的序列设计引物,选择RefSeq mRNA database,物种是Human,其它默认。结果如下图A-B所示,设计的引物只能扩增出UNG2。看上面的图,把“Allow primer to amplify mRNA splice variants”这个选项给勾上,出现的结果如下图-C所示,新的引物也可以扩增出UNG1(注:我试了一下,不能得到预期的结果,可能参数没设对)。 Figure. Primer-BLAST results for UNG transcript variant 2. The NCBI Reference sequence NM_080911 was used as a template. Top panel: Primers specific to the single splice variant are reported by default with the mRNA RefSeq database limited to human sequences. Bottom panel: Primers that amplify both splice variants are found with the option to allow splice variants.(点击看大图) 一些Tips1,在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession 号(尽量不要Fasta格式的序列)。另外,确保你的序列是最新版本的(在填Accession Number时后面不加版本号就会自动拿最新的序列) 1. Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000) Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386. |
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来自: Nolan John > 《我的图书馆》