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当大家还在为发一篇5分SCI，起早贪黑地做艰难的分子机制时，有些人却只做了体内外功能实验就发了Cell，气不气人？！两眼放光了吧，一起来了解一下。 小伙伴们平常如何寻找差异mRNA、lncRNA的呢？是不是上测序、上芯片？OUT了，以前可能是，但现在不一定了！现在有一个新的方法，只要筛选差异分子研究一下就能发CNS！这个技术和CRISPR有关。 CRISPR很火，火到什么程度了呢？举个栗子，已经被美国大片搬上了荧屏，最近比较火的《狂暴巨兽》，导演说这可爱的猩猩、鳄鱼、野狼就是CRISPR基因编辑技术的产品。 虽然比较假，但也证明了CRISPR确实引发了科研圈之外的公众的普遍关注。 CRISPR的SCI文章发表趋势
今天给大家带来的这篇Cell文章的核心技术就是：CRISPR功能基因筛选。 单位：哈佛医学院 实验室：著名癌症遗传学家Pier Paolo Pandolfi 疾病：AML-急性髓系白血病 时间：2018.4.19 关键词：基因转录激活;lncRNA;AML阿糖胞苷耐药基因筛选 研究内容：阿糖胞苷(Cytarabine,Ara-C)是一种治疗AML的药物，但往往产生耐药，机制不明。作者利用CRISPR全基因组功能基因筛选的原理构建了dual protein-coding and non-coding integrated CRISPRa screening (DICaS)，翻译过来就是“同时筛选有功能的mRNA、lncRNA的CRISPR文库sgRNA筛选技术”。这个文库的构建质量才是最关键的核心。但是这里的文库不是采取“基因敲除”的手段，而是通过“随机激活lncRNA、mRNA的转录表达”的方式，筛选针对AML的阿糖胞苷耐药RNA。最后发现lncRNA GAS6-AS2的激活，会介导耐药的产生。 “筛选”耐药基因的思路
实验流程解读如下： （1）不用RNA-seq却用CRISPR文库技术筛选 1.科学问题提出（例：耐药基因） ↓ 2.建立稳定的细胞模型 ↓ 3.购买或自己构建sgRNA文库 ↓ 4.制备含有文库的细胞 ↓ 5.用文库细胞进行细胞模型实验 ↓ 6.细胞基因组提取，获得sgRNA序列 ↓ 7.测序获得初筛基因 ↓ 8.基因功能验证
（2）CRISPR筛选技术：改造的sgRNA文库随机激活基因的转录 把Cas9的切割功能失活却保留识别特异基因的功能！相当于把真子弹换成了橡胶弹，然后在Cas9上面装载转录因子等激活基因转录的因子，这一招叫做“随机靶向激活”。
（3）CRISPR耐药基因sgRNA文库的构建 肯定不能随机合成所有已知基因的sgRNA，所以需要对潜在的耐药基因做尽可能的进一步筛选，方法是根据Cancer Target Discovery and Development (CTD2) database以及the Cancer Cell Line Encyclopedia (CCLE)数据库中的样本以及细胞株的耐药基因做初筛，然后再构建耐药基因CRISPR sgRNA文库。
已知数据库中的耐药数据集的基因功能注释，为建库筛选靶基因
（4）Ara-C耐药基因的筛选 构建好的sgRNA文库，转染AML细胞系，亚克隆后进行分别培养，并使用Ara-C进行耐药筛选（设置对照组），那些存活下来并且增殖的细胞中，被激活的基因或者lncRNA被认为和耐药有关，会被富集出来，于是对这些存活的细胞进行RNA-seq，分析差异表达的mRNA和lncRNA。 耐药基因筛选策略、差异mRNA、差异基因的通路富集分析
部分差异基因预后分析、过表达后耐药实验、细胞凋亡检测
（5）Ara-C耐药lncRNA的筛选以及功能实验 这一部分就是耐药lncRNA的细胞与动物的功能实验，没有做分子机制的研究，我相信这是作者下一篇Cancer Cell要做的内容。 差异的lncRNA解析、lncRNA分类、火山图展示
差异表达的lncRNA的通路富集分析（GAS6-AS2）
GAS6-AS2的细胞耐药的凋亡检测，预后分析
GAS6-AS2的动物耐药实验、体内AML细胞凋亡检测 附录： 2018年CRIPSR功能基因筛选相关文章举例： 1. An Integrated Genome-wide CRISPRa Approach to Functionalize lncRNAs in Drug Resistance.Cell.2018.4.19 2. Defining essential genes for human pluripotent stem cells by CRISPR-Cas9 screening in haploid cells.Nat Cell Biol. 2018 Apr 16 3. TRRAP is essential for regulating the accumulation of mutant and wild-type p53 in lymphoma.Blood. 2018 Apr 13 4. LKB1, Salt-Inducible Kinases, and MEF2C Are Linked Dependencies in Acute Myeloid Leukemia.Mol Cell. 2018 Mar 15 5. Genome-wide CRISPR-Cas9 Screen Identifies Leukemia-Specific Dependence on a Pre-mRNA Metabolic Pathway Regulated by DCPS.Cancer Cell. 2018 Mar 12 6. A CRISPR screen identifies CDK7 as a therapeutic target in hepatocellular carcinoma.Cell Res. 2018 Mar 5 7. CRISPR-Cas9 screen reveals a MYCN-amplified neuroblastoma dependency on EZH2.J Clin Invest. 2018 Jan 2
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