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16S rRNA测序是利用高通量测序技术，通过检查环境微生物（主要是细菌）16S特定可变区的丰度，以此鉴定生物标本细菌群落的分类及丰度的一项技术。16S rDNA指细菌基因组中编码核糖体16S rRNA分子对应的DNA序列, 也就是16S rRNA的编码基因。16S序列由9个高变区组成，中间穿插着保守区，是最常用的细菌分类标准（图1）。通过提取环境样品的DNA，扩增其中16S rRNA基因，可以鉴定绝大多数细菌。 图1 16S rRNA基因的9个可变区的分布情况 基于Illumina MiSeq平台的16S rRNA测序可以一次性完成多个样本的平行测序，提供生物样本物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息（图2）。尽管使用16S rRNA 基因作为分子标志物时也存在诸多问题,比如水平基因转移、多拷贝的异质性和基因扩增效率的差异等,这些问题会直接或间接的影响到微生物群落组成和多样性分析时的准确性，然而瑕不掩瑜，近些年来随着高通量测序技术及数据分析方法等的不断进步,大量基于16S rRNA 基因的研究使得微生物生态学得到了快速发展。16S rRNA数据结果与全基因组测序数据结果在分类和丰度的结果上整体相似，且同时拥有可控制性强，价格实惠和周期短等诸多优点，16S rRNA 基因目前也是成为了最常用的生物标志物,被广泛应用于微生物的系统进化、分类及多样性研究之中。 图2 16S/18S/ITS测序流程示意图 接下来的内容将主要介绍一下在得到高通量测序数据之后，如何使用生物信息学技术来解释16S rRNA测序数据，解答样品微生物群落的分类和丰度。目前在已发表的文章之中，最有影响力的两个生物信息学软件包分别是QIIME和Mothur：这两篇文章在SCI的引用次数加起来就高达19000次，几乎每一篇16S相关的文章都与他们两人相关。 图3 QIIME和Mothur研发实验室主要PI 但本文要着重提到的是还未发表的但已经早已投入使用的QIIME2平台。QIIME2是Rob Knight实验室和Greg Caporaso实验室（QIIME文章的第一作者，现在拥有独立实验室）共同开发的一款跨时代革命性的全新扩增子微生物组分析流程。QIIME2的开发时间已经超过三年，并已于2018年1月全面接档QIIME1。尽管关于QIIME2的文章还没有正式发表，但已经有很多的实验室开始使用发表文章（依旧引用QIIME1以表达心意）。QIIME2不是QIIME1的一个简单升级，它是一次采用python3完全的重写。QIIME2克服了几乎所有的已知的缺点，把现已发表的评价最好的所有软件或者分析方法都囊括其中，集众家之长变成一个综合的平台体系。为什么这么说，让我们来列举一下QIIME2的优点：
用我一个大牛朋友的话来说就是，QIIME2完全没有缺点，看不到对手，它将是未来扩增子分析的绝对分析标准。让我们拭目以待QIIME2时代的到来！ 鉴于此，我们将推出一系列免费网络直播讲座，介绍QIIME2及其安装和使用等细节，欢迎参加。2018年5月5日，将推出第一场。参加方式请点击以下链接：学术公开课通知：《微生物扩增子分析全新流程QIIME2介绍与使用实例》，5月5日 本文来自多篇文章的改写和引用，特感谢以下参考文献： 1.刘驰, 李家宝, 芮俊鹏, 安家兴, 李香真.16S rRNA 基因在微生物生态学中的应用.生态学报,2015,35(9):2769-2788. 2.张国林, 苏远科, 沈海英等. 16S rRNA/ITS 基因序列分析与微生物分类鉴定及其在药品微生物质量控制中的应用. 中国现代应用药学, 2017, 34(10): 1489-1495. 3. Genewiz官网16S/18S/ITS测序及宏基因组测序介绍. 4.QIIME2中文帮助文档(Chinese Manual). |
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