一篇Cell文章说明ceRNA研究思路

yjt2004us 2018-05-02

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那么问题来了，我想研究这个炙手可热的新明星，应该怎样研究呢？

今天就以一篇2011年发表在Cell上的文章，来指导大家ceRNA研究的具体思路和方法。这篇文章研究的是ceRNA领域里研究得最多的抑癌基因PTEN，引用次数高达380多次！里面对于ceRNA的预测和验证思路都非常值得我们学习~~

与PTEN相关的ceRNA除了假基因PTENP1，还有很多蛋白编码基因，具体调控网络如下图：

是不是感觉已经亮瞎了？ceRNA调控网络就是那么复杂！这篇文章主要关注蛋白编码基因，通过计算机预测和多步生物学实验验证，验证了两个蛋白编码基因——VAPA和CNOT6L，参与了PTEN的ceRNA调控网络。

文章的整体研究思路如下图，主要分为三步：

计算机预测PTEN的潜在ceRNA;
多个方面验证这些基因是PTEN的ceRNA；
验证这些ceRNA是否有肿瘤抑制作用。

第一步：计算机预测PTEN的潜在ceRNA

由于ceRNA理论的基础是microRNA反应元件（MRE），各个ceRNA通过各自转录本上的相同MRE相互调控和交流。因此，要研究ceRNA调控网络，首先就要通过生物信息预测转录本上的MRE，找出与目的转录本相关的候选ceRNA。

文中利用之前已验证过的10个PTEN靶标miRNA，用rna22 miRNA靶标预测软件在人类全部蛋白编码转录本中预测MRE。

预测参数如下：

被至少7个PTEN miRNA靶向；
所有预测的MRE只发生在候选ceRNA的3’UTR区。

结果：共预测出158个候选蛋白编码转录本。这些候选基因将进行下一步的实验验证。

第二步：多个方面验证这些基因是PTEN的ceRNA

生物信息学验证出来了，还要进行一系列的实验研究、从多个方面来验证这些基因就是PTEN的ceRNA。

由于ceRNA是通过共同的MRE与目标mRNA争夺miRNA，从而调控基因的表达。因此文中主要是从下图的三方面去验证：

与PTEN共表达；
能影响PTEN的蛋白水平和转录本水平；
调控作用是miRNA依赖的。

1. 与PTEN共表达

方法：选择了得分最高的7个候选基因（NCOA7, BCL11B, SERINC1, ZNF460, NUDT13,DTWD2, VAPA），并从NCBI上下载了前列腺癌和胶质母细胞瘤的基因表达数据，研究这些ceRNA与PTEN表达量的相关性。（选择前列腺癌和胶质母细胞瘤是因为这两个肿瘤中，PTEN的表达水平是明显下降的。）

结果：综合了数据中PTEN基因表达量和miRNA表达量，找出与PTEN相关性最高的ceRNA作为候选基因，最后选择了SERINC1, ZNF460, VAPA和CNOT6L这四个显著相关基因进行后续的实验验证。（CNOT6L是从得分最低的候选基因中鉴定出来的，因为其表达量与PTEN的表达量相关性也非常显著。）

2.能影响PTEN的蛋白水平和转录本水平

作为PTEN的ceRNA，肯定要能影响PTEN的表达水平的。因此，文章接着对上述筛选出来的四个候选基因进行PTEN调控的影响。

方法：siRNA干扰knockdown 候选ceRNA的表达水平，然后利用细胞转染、western blot、qPCR、荧光素酶报告实验等方法检测PTEN的蛋白表达水平和转录水平。

结果：siRNA干扰SERINC1, ZNF460, VAPA和CNOT6L使PTEN的蛋白表达水平显著下降，同时PTEN转录本水平也出现了下降。

PTEN转录本的水平也下降了，虽然没有蛋白水平显著，但是这现象也刚好验证了我们在上上期的综述里提到的在动物中miRNA与靶基因的结合也是可以导致靶mRNA降解的，从而miRNA的抑制作用也可以在转录本水平被检测到（戳这里查看~）。

另外，进一步构建了PTEN 3’UTR荧光素酶载体，来研究这些调控作用是否依赖于3’UTR区。结果也发现SERINC1, VAPA和CNOT6L的knockdown显著降低了荧光素酶活性。

但是ZNF460的knockdown并没有显著降低PTEN 3’UTR荧光素酶的活性，说明了其对PTEN的调控不仅仅在3’UTR区，因此后续就不再研究这个基因了。

ceRNA的knockdown能使PTEN的表达水平下降，那么过表达呢？

实验结果也在我们预料之中，过表达ceRNA3’UTR会导致PTEN蛋白表达水平显著上升。

3.调控作用是miRNA依赖的

由于ceRNA调控网络的核心是microRNA，因此要研究这些候选ceRNA对PTEN的表达调控作用是否是依赖于microRNA。

方法：使用DICER酶突变的结肠癌细胞系和野生型细胞系来做上述的siRNA干扰实验。 DICER酶突变导致不能产生成熟的miRNA。

结果：在野生型细胞系中，siRNA干扰导致的SERINC1, VAPA和CNOT6L表达下降导致了PTEN蛋白水平的显著下降，而在DICER酶突变细胞系中，PTEN蛋白水平并没有下降，说明了这三个候选ceRNA对PTEN的调控作用依赖于成熟的miRNA。

接下来研究这些候选ceRNA是否与PTEN争夺相同的miRNA，这也是ceRNA假说的核心。

由于VAPA和CNOT6L这两个候选基因在前面的实验中有最显著的效果，因此后续的实验主要研究这两个基因了。

结果：采用荧光素酶报告基因实验方法，构建了ceRNA3’UTR荧光素酶载体，发现不同的PTEN靶标miRNA的表达分别显著下调了VAPA和CNOT6L的表达水平，并得到了PTEN的10个miRNA在VAPA和CNOT6L 3’UTR上的作用位置，这与先前计算机预测的结果一致。

第三步：验证这些ceRNA是否有肿瘤抑制作用

通过上述各个方面验证了这些候选ceRNA真的是PTEN的ceRNA后，我们会关心其生物学意义，这些ceRNA是否参与了肿瘤抑制过程？所以接着的验证实验也是非常重要，是决定发高分文章的关键。

这部分主要也是从多个方面验证：

对PI3K/AKT癌症发生信号通路的影响
对细胞增殖的影响
对癌细胞克隆形成的影响
ceRNA基因拷贝数变化

1.对PI3K/AKT癌症发生信号通路的影响

PI3K/AKT信号通路在肿瘤中异常激活，因此研究ceRNA对该通路的影响可以得知ceRNA的作用。

结果：在两种细胞系中（DU145和HCT），VAPA和CNOT6L的表达量下调都可激活PI3K/AKT信号通路，并且该过程依赖于miRNA。说明VAPA和CNOT6L通过与PTEN相互调控，来抑制PI3K/AKT信号通路。

2.对细胞增殖的影响

结果：VAPA和CNOT6L表达量的下降显著加速了肿瘤细胞增殖，而这种效应在DICER酶突变细胞系中显著减弱。

3.对癌细胞克隆形成的影响

形态学观察上， VAPA和CNOT6L表达量的下降促进了肿瘤细胞的非锚定生长。

4.ceRNA基因拷贝数变化

通过分析大量结直肠癌数据，发现VAPA和CNOT6L基因的拷贝数在肿瘤中发生丢失。

总结

通篇文章解读下来，我们可以脑补一下这个ceRNA调控关系：

PTEN与VAPA、CNOT6L通过相同的MRE争夺相同的miRNA，当VAPA、CNOT6L表达量降低时，会释放出更多的miRNA，这些miRNA从而更多地结合PTEN，抑制PTEN的表达，从而激活肿瘤信号通路，促进了肿瘤生长。反之亦然。

文章论证严谨、有序，整体的研究思路非常值得我们借鉴：

文章结合生物信息学预测和实验验证，不仅通过计算机预测找出了候选ceRNA，更是通过一系列的功能实验，有力地证明这些候选基因与PTEN存在着ceRNA调控作用，并参与了肿瘤生长抑制。
功能实验的验证非常严谨，不仅验证候选基因就是PTEN的ceRNA，还进一步验证了这些候选基因在人类肿瘤中的作用；不仅验证Knockdown，还验证过表达；不仅验证整个基因，还验证3’UTR区；从多个角度、多个实验来验证，比如通过研究信号通路、细胞增殖、克隆形成和拷贝数变化等来研究候选ceRNA对肿瘤生长的影响。

另外，我们从这篇文章中，也能得出关于ceRNA假说和调控网络的几个重要结论：

蛋白编码基因也能作为ceRNA网络中的成员，与其他mRNA一起竞争相同的miRNA，这对“编码基因必须被翻译成蛋白才能发挥功能”这一传统理论做出了挑战，揭示了蛋白编码基因的其他重要功能；
这些ceRNA调控作用通过MRE实现，这启示我们，可以通过计算机预测ceRNA网络中的成员。