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导读 核糖体小亚基（英文：Ribosomal Small
Subunit，简称“SSU”）是核糖体中较小的核糖体亚基。每个核糖体都由一个核糖体小亚基与一个核糖体大亚基共同构成。小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）基因，如细菌中的16S和真核生物的18S，是微生物的分子“身份证”，常用于微生物多样性和分类等研究。传统方法难以避免扩增引物偏倚性影响结果，而对SSU
rRNA进行全长测序可以消除这种局限性，更准确的鉴定微生物。1990年，有研究报导能够从复杂环境样品中获得的一些16S rRNA序列，打开了研究地球上未知微生物世界的大门。近年来，SSU rRNA 的测序常常用于微生物的研究。SILVA数据库中约有近200万条的全长SSU序列。大多数全长的SSU序列都是通过PCR扩增，测序拼接获得的，成本高。二代测序的得到的序列短，虽然三代测序序列长，但测序错误率高，通量低，价格贵。测序技术的缺陷、缺少好的通用引物等限制了研究者发现、认识新的物种。 本研究基于SSU共有的poly（A）合成cDNA，构建文库进行测序，分析7种环境样本的微生物群落构成。 本研究基于SSU共有的poly（A）合成cDNA，构建文库进行测序，分析7种环境样本的微生物群落构成。
原名：Retrieval
of a million high-quality, full-length microbial 16S and 18S rRNA gene
sequences without primer bias 译名：基于16S和18S rRNA基因的全长无偏差测序研究微生物多样性 期刊：Nature
biotechnology IF：41.667 发表时间：2018年 通讯作者：Mads Albertsen 作者单位：奥尔堡大学 1 测序方法的建立 1.1 DNA样品准备 提取样品中RNA，采用凝胶电泳法选择目标片段。基于核酸poly（A）合成单链cDNA。依据模板合成双链cDNA。 
图1 cDNA合成过程 1.2 构建文库测序 双链DNA片段进行扩增，采用凝胶电泳法进行纯化，纯化后片段再次扩增，用于建立测序文库(Read-tag library)与建立接头文库(Linked-taglibrary)。拼接测序片段， PCR扩增，高通量测序获取SSU序列，利用inner引物扩增接头文库进行测序。 
图2 构建文库测序 将具有相同接头文库的序列归为一类，分为一类的基因序列进行拼接，获得SSU的全长序列，进行物质注释。 
图3 数据分析 本研究获得了61,266条古细菌全长16S序列，比目前整个SILVA数据库中的古细菌序列还多。通过聚类之后，得到3,410个古细菌的OUT；获得了70,883条真核生物18S序列，得到415个真菌的OTU。获得的1，168，276 条LSU 序列，比目前整个SILVA数据库的LSU序列还要多。通过序列相似度比对细菌和古细菌数据库，发现了大量新的纲、目、科等分类单元。同时，系统发育分析显示几个位于系统发育树底部的古细菌与已知的任何古细菌分支聚在一起，而是单独聚成几支。
图4 生命树覆盖率 本研究采用Escherichia coli MG 1655, Bacillus subtilis str. 168和 Pseudomonas aeruginosa PAO1 3种菌的混合群落，评估研究方法的错误率以及嵌合体数量。结果显示，在一个Illumina MiSeq Run 中，平均的测序错误率为0.17%，嵌合体比例为0.4%。测序错误率与PCR反应时的Taq酶的错误率基本一致。嵌合体比例比传统的基于PCR反应的方法低50倍。
图5 古细菌覆盖率 本研究通过多步骤优化得到小亚基核糖体RNA（SSU rRNA）全长cDNA，采用高通量方法获得高质量、无引物偏倚的SSU rRNA全长序列。建立方法分析不同环境中的微生物群落构成。结果显示，该方法的错误率低，结果信息量大，发现约50%的新物种。通过与SILVA数据库进行比对，发现了大约有58%的OTU与SILVA差异度大于97% ，可见环境中还有大量的新物种未被人们发现。 本研究依据核糖体的全长对不同环境中的样品进行研究，该方法能够有效扩充现有数据库，完善微生物的分类，促进人类对地球上未知微生物的认识。 本文由李红霞编译，李红霞、江舜尧编辑。
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