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鉴定生物样本中的微生物有两种常用方法。其中，宏基因组测序法是对样本中任何微生物的全基因组进行测序，这种无偏差的方法无需进行培养，故而能鉴定目前无法培养的生物。而传统的短读长测序技术很难可靠地解析重复区域 ，以致在近缘物种的分类学分类和基因组组装中挑战重重。 16S rRNA基因测序广为应用的原因，是因其结合了保守和高度可变区，能进行准确区分物种。通常用于这类实验的16S引物并不覆盖整个16S基因区域，然而由于有些带有分类信息的区域落在被分析的扩增子之外，这可能使物种鉴定的分辨降低。 在基于16S的研究中，纳米孔技术允许设计引物覆盖整个16S基因，甚至整个核糖体操纵子，这通常使得纳米孔测序在准确分辨更多物种的表现优于传统测序平台。并且，纳米孔长读长更适合组装重复的基因组区域，提高宏基因组物种鉴定的精度。DNA和RNA修饰，如甲基化在微生物群落中的角色受到越来越多的关注。然而，由于需要预先对样本进行亚硫酸盐处理或抗体沉降（pull-down）的预处理，这样的修饰不易用传统技术检测。纳米孔平台能够对宏基因组或靶向富集样本中的基因组DNA和cDNA进行测序，生成的长读长适用于准确的分类学归类和转录组学研究。
研究案例 1 与婴儿相关的肠道微生物群（BAMBI） —— 临床案例 纳米孔测序能在测序的1小时内进行病原体鉴定和AMR分析。 坏死性小肠结肠炎是影响早产和体重不足的婴儿最严重的肠胃疾病之一。微生物菌群失调/失衡被认为是该病最可能的潜在致病因素。这种疾病在早期难以诊断，并常常与爆发性恶化有关。目前发现与之关联的病原体包括产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens）和肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）。有研究显示，患有坏死性小肠结肠炎的早产儿具有更多的潜在致病菌，而有益的两歧双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）则较少。 由Leggett, R.M. 等带头的英国研究团队使用宏基因组纳米孔测序，分析了早产儿的肠胃微生物群，进行物种鉴定，并对抗微生物药物耐药性（AMR）进行量化和分析。作者在文章中提出：能够自信地检测（i）物种的微生物，提供准确诊断的水平；（ii）微生物群内的物种丰度（如这些细菌也可以存在于更广泛的微生物社区内，但在低水平时不会引起疾病）；（iii）抗微生物药物耐药性基因库，对诊断非常重要。 此项研究作为一项益生菌临床试验治疗的一部分，通过一个时程实验（time-course experiment），该团队观察了益生菌和抗生素治疗对微生物组成的影响。研究发现，在施用益生菌后，婴儿肠道中的两歧双歧杆菌（B. bifidum ，鉴定至种属层级）数量增加，使用长读长纳米孔测序和短读长两种平台均得到相似的分析结果。研究人员还注意到，与使用短读长测序平台的16S rRNA分析相比，纳米孔宏基因组测序方法能够得出更细化的分类，而短读长测序无法区分肠杆菌属 （Enterobacteriaceae）中的物种。 该团队通过对一个重症婴儿的粪便样本进行实时分析，成功在测序一小时内识别出肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）病原体的存在，并进行了相应的 AMR分析。 研究人员发现，纳米孔测序数据的质量与短读长测序所得相当。然而，所需时间为纳米孔测序5小时 ，短读长测序39小时。 文献: doi: https:///10.1101/180406 **纳米孔测序目前仅供研究使用 研究案例2 鼠肠道微生物组 相较于种属鉴定时常用的V3-V4 16S区的方法，纳米孔测序实现的全长16S 基因的方法敏感度更高。 基于16S的种属鉴定是微生物组研究中最常用的方法。Shin 等使用16S法，应用短读长测序技术或纳米孔长读长测序技术来研究鼠肠道微生物群的组成。 这两种方法之间的一个关键区别在于，在短读长实验中，V3-V4 16S高变区被用来设计引物和生成扩增子，平均读长为447bp。而纳米孔测序使用了全长16S基因，平均读长为1393bp。两个平台得出的测序数据在除种属层级外的所有分类层级都表现出了高度一致性（R2=0.8-0.9）。 研究显示，纳米孔数据能鉴定出更多种属，例如肠道微生物组中的动物双歧杆菌和假长双岐杆菌，从而实现更加完整的微生物群代表结构。该研究表明，相较于种属鉴定时常用的V3-V4 16S 区的方法，通过纳米孔测序实现的全长16S基因的方法敏感度高。作者由此得出结论，相比于短读长技术，纳米孔测序长读长的优势有助于更精确地分析鼠肠道微生物组。 图1. 16S rRNA基因序列中的变异性。黑色及红色箭头分别代表V3-V4区扩增引物组的结合位置以及16S rDNA序列（纳米孔测序）的近全长区。 文献: doi: www./10.1038/srep29681 研究案例 3 使用核糖体操纵子进行种属鉴定 我们的分析表明，MinION有能力提供足够优质的rRNA 操纵子序列数据，来表征复杂环境样本中的生物群，并提供可再现、量化、且一致的结果。 罗格斯大学的Lee Kerkhof教授使用完整的rRNA操纵子序列，而非仅用16S，通过纳米孔测序进行细菌微生物组分析。他们在16S rRNA基因序列内生成正向引物，在23S rRNA基因内生成反向引物后，得到了一个4.2kb的片段（图2）。该团队测序了6个环境样本，每个样本都由农田土壤DNA和生物反应器DNA组成，混合比例各异。经过12个小时的测序，生成1000 多个操作分类单元（OTU）*，并且各重复之间的一致性较好。 团队成功构建了共有操纵子（consensus operons），其中每个rRNA操纵子均含有一条16S和 23S基因。研究结论认为，使用纳米孔测序操纵子，相比于使用短读长的标准16S测序，能够分辨更高的分类。并且使用的方法实现了OTU的精确定量。团队现正在拓展其研究以阐明外部因素（如暴露于毒素中）对鼠微生物组组成的影响。 图2. 核糖体操纵子测序（4.2kb）扩增子结构，包含近全长的16S和23S序列。 文献： doi: www./10.1186/s40168-017-0336-9 研究案例 4 16S rRNA直接测序 纳米孔直接 RNA测序技术有望快速鉴定环境和患者样本中的微生物。 迄今为止，大部分微生物组学的研究重点都是通过分析DNA来阐明微生物的组成和基因组结构。如今，测序技术和工作流程的进步使得研究人员能够对RNA进行探索，进而深入了解复杂细菌群落中的基因表达。 表观遗传修饰的分析进一步细化了对微生物群落及其环境响应的表征。但是，这种修饰在使用传统测序技术时会被“抹掉”。 在一项原理验证研究中，加州大学圣克鲁兹分校的Andrew Smith博士及其同事使用纳米孔测序直接分析大肠杆菌全长（1.5kb）16S核糖体RNA（rRNA），通过单次测序运行鉴定核苷酸和表观遗传构成。 16S rRNA 是小核糖体有亚基的核心组成部分。核糖体亚基在所有活细胞中均有表达，并在RNA翻译过程中扮演重要角色。许多抗生素都是以原核核糖体为靶点。这些核糖体通过核苷酸替换或碱基修饰的增加或减少，获得耐药性。 研究团队开发了一种富集策略，使得他们可以在4.5 µg总人类RNA的背景下，研究仅5 pg的大肠杆菌16S rRNA。纳米孔技术提供的实时分析可以在测序开始后的20秒内生成16S rRNA序列。 通过研究数据，研究人员在16S rRNA（图3）的已知位点鉴定出了7-甲基鸟苷（m7G），并观察到包括假尿嘧啶核苷在内的其他表观遗传修饰的存在。团队报告说，基于纳米孔的测序分析从采样到出结果只需两小时，这使得它在临床可行的时间框架内进行测序。  图3. 纳米孔测序准确检测到大肠杆菌16S rRNA 527 位点上的m7G表观遗传修饰。 |
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