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智力障碍/发育迟缓(ID/DD)是指发育成熟以前(18岁以前)出现的认知和适应行为障碍。ID用于5岁以上儿童，此时智商(IQ)测定已比较可靠稳定；DD用于5岁以下的儿童，诊断标准为患儿存在2个或2个以上的发育能区的显著落后。国外报道ID/DD的患病率为1%～3%[1]，我国智力残疾患病率为0.75%[2]。ID/DD异质性强，病因复杂，世界卫生组织(WHO) 2013年报道>50%的ID/DD病因不明，我国约2/3病因不明[3]，这与我国ID/DD病因诊断不规范有关。 ID/DD患病率较高，且多数ID/DD尚无有效治疗办法，故明确病因诊断，做到一级预防尤为重要。本研究在既往神经发育障碍性疾病病因诊断流程[4]基础上建立了规范化ID/DD病因诊断流程(图1)，按此流程对30例原发性ID/DD患儿进行临床及遗传学分析，以明确病因诊断。 图1 原发性ID/DD患儿病因诊断流程 Figure 1 Diagnosis flow process of etiology on idiopathic ID/DD 注：ID：智力障碍；DD：发育迟缓；MLPA：多重连接依赖的探针扩增技术 ID：intellectual disability；DD：development delay；MLPA：multiplex ligation－dependent probe amplification 图1 原发性ID/DD患儿病因诊断流程 Figure 1 Diagnosis flow process of etiology on idiopathic ID/DD 1 资料与方法 1.1 研究对象 选择2014年4月至2014年8月在北京大学第一医院儿科门诊就诊的30例(编号P1～P30) ID/DD患儿，男女各15例，中位年龄5岁5个月。纳入标准：(1)临床表现为智力运动发育落后；(2)无明确缺氧、中毒、中枢神经系统感染及头颅外伤病史。 1.2 方法 1.2.1 收集资料 收集临床资料，完善生化、代谢、神经影像学检查。本研究已获得医院医学伦理委员会批准，患儿家长均签署知情同意书。 1.2.2 采集标本 采集患儿及其家属外周静脉血各3～5 mL，采用FlexiGene DNA Kit (德国Qiagen公司)提取DNA，－80 ℃冰箱保存待用。部分外周血进行混合淋巴细胞培养，用于染色体核型分析。 1.2.3 染色体核型分析 应用常规G显带核型分析染色体结构及数目。 1.2.4 多重连接依赖的探针扩增技术(MLPA) 运用MLPA检测染色体亚端粒缺失/重复，检测试剂盒(P070、P036、P106)均购自荷兰MRC-Holland公司。 1.2.5 目标基因靶向捕获-高通量测序 参考数据库OMIM以及HGMD，检索并设计遗传性ID/DD相关的450个基因Panel，进行目标基因靶向捕获-高通量测序，筛查ID/DD相关单基因病。 1.2.6 染色体基因芯片分析(CMA) 应用CMA检测基因组拷贝数变异(CNVs)，所用芯片为美国Affymetrix公司CytoScan HD芯片(与上海市儿科医学研究所和复旦大学生命科学学院合作完成)。 1.2.7 遗传变异致病性分析 对发现的遗传变异逐步进行多态性分析-文献/数据库检索-家系验证-蛋白结构影响预测等方法，判断变异的致病性可能。 2 结果 2.1 临床分析 30例患儿均表现智力和运动发育落后(表1)，无继发性脑损伤病史。23例行发育评估提示轻到极重度发育落后。12例(40.0%，12/30例)伴颅面部外观畸形、通关掌、多指、房间隔缺损等先天畸形，8例(26.7%，8/30例)有注意力不集中、多动、脾气暴躁、孤独症样表现等精神行为异常，4例(13.3%，4/30例)有惊厥，2例(6.7%，2/30例)视力差，2例(6.7%，2/30例)有惊跳反射，1例(3.3%，1/30例)有阳性家族史，母亲处于智力障碍边缘状态。21例行生化、代谢等检查，均未见明显异常；28例行头颅MRI检查，15例(53.6%，15/28例)有脑白质、大脑皮质、胼胝体发育不良、脑室扩大等异常发现。30例均为原发性ID/DD，1例(P4大头畸形，前额、下颌突出，耳位高，眼裂下斜，生长过速，身材细长)临床诊断Sotos综合征，29例病因诊断不明确。
表1 智力障碍/发育迟缓患儿30例临床特点 2.2 遗传学分析 30例ID/DD患儿中，29例(P1～P29)发现遗传变异，遗传变异检出率96.7%(29/30例) (数据未列出)，8例(P1、P2、P4～P9)变异为致病性(表2)，病因诊断明确，诊断阳性率26.7%(8/30例)。22例行染色体核型分析，1例(P1)发现异常：46，XX，del(22)(q13.3)，染色体核型诊断阳性率为4.5%(1/22例)。30例行MLPA，2例(P1、P2)发现染色体亚端粒缺失：P1 22qter del，P2 15qter del，其父母该区域均未见异常；1例(P3)发现染色体亚端粒重复：7qter dup，遗传自其表型正常的父亲；余27例未见异常；2例(P1、P2)病因诊断明确，MLPA诊断阳性率为6.7%(2/30例)。P4行荧光原位杂交(FISH)未发现可导致Sotos综合征的5q35区域的缺失/重复。30例行目标基因靶向捕获-高通量测序，28例(P1～P9，P11～P29)存在ID/DD相关基因变异，4例(P4～P7)变异为致病性突变，病因诊断明确，基因Panel诊断阳性率为13.3%(4/30例)：P4 NFIX c．613C>T(p.Q205X)杂合突变，父母此位点为野生型(图2A)，Q205X不属于多态性改变，不同物种间氨基酸序列比对提示p.Q205位点氨基酸保守性好(图2B)，p.Q205X为截短突变预测会影响蛋白质结构，提示突变有害；P5 DHCR7 c．901C>A(p.H301N)，c.1376G>A(p.W459X)复合杂合突变，2个变异位点分别遗传自父亲、母亲；P6、P7分别为UPF3B c．1034G>A(p.R345H)和DLG3 c．128G>T(p.G43V)半合子突变，均遗传自其杂合子的母亲。7例行CMA，4例(P8～P11)发现CNVs：P8 chr11：123794665-127550567单拷贝增加，P9：chr15：56938298-61806136杂合缺失(图3)，其父母该区域均未见异常；P10：chr11：23527905-25050275杂合缺失，P11 chr5：108996132-109172348杂合缺失，均遗传自其表型正常的母亲，2例(P8、P9)病因诊断明确，CMA诊断阳性率为28.6%(2/7例)。 图2 P4家系NFIX Sanger测序图及NFIX p．Q205位点氨基酸保守性 Figure 2 Sanger sequencing of NFIX for P4 family and conservation of anion acid residue at NFIX p．Q205 注：A：P4 NFIX c．613C>T杂合突变，P4父亲、母亲NFIX c．613C为野生型(箭头所示)；B：NFIX p．Q205位点在不同物种间氨基酸保守性好(数据来自UCSC Genome Browser数据库) A：P4 NFIX c．613C>T hete-rozygous mutation，and his parents NFIX c．613C were wild type(arrow)；B：NFIX p．Q205 was conserved across different species (data from UCSC Genome Browser database) 图2 P4家系NFIX Sanger测序图及NFIX p．Q205位点氨基酸保守性 Figure 2 Sanger sequencing of NFIX for P4 family and conservation of anion acid residue at NFIX p．Q205 图3 P8家系染色体基因芯片分析 Figure 3 Chromosomal microarray analysis for P8 family 注：P8：chr11：123794665-127550567(hg19)，拷贝数变异大小：3 756 kb，CN State：3，染色体上的位置：11q24.1-24.2；P8父亲、母亲该区域均未见异常 P8 with a duplication of chr11：123794665－127550567(3 756 kb) (hg19)，mapping to 11q24.1－24.2，CN＝3；his father and mother were normal in the same area 图3 P8家系染色体基因芯片分析 Figure 3 Chromosomal microarray analysis for P8 family
表2 智力障碍/发育迟缓患儿30例遗传学分析 3 讨论 ID/DD病因复杂，外在环境因素约占20%，内在遗传因素约占2/3[5]。国外约50%病因诊断明确，国内仅30%病因明确[3]。国内既往相关研究多运用单一的遗传学检测方法，本研究按照规范流程运用多种检测方法对可能的病因进行综合判断，提高病因诊断率，但病例数较少，仅7例进行CMA检测，总诊断阳性率可能偏低，需扩大样本量进一步验证。 30例原发性ID/DD中，先天畸形(40.0%，12/30例)和精神行为异常(26.7%，8/30例)较常见，与既往文献数据基本相符[6]。少数患儿有惊厥(13.3%，4/30例)、视力差(6.7%，2/30例)、惊跳反射(6.7%，2/30例)。1例(P4)临床诊断为Sotos综合征，29例病因诊断不明确。 经遗传学检测，96.7%(29/30例)发现遗传变异，26.7%(8/30例)变异有致病性，发现4种基因的5种未报道的新突变：NFIX c．613C>T (p.Q205X)(P4)，DHCR7 c．1376G>A(p.W459X)与c.901C>A(p.H301N)(P5)，UPF3B c．1034G>A(p.R345H)(P6)，DLG3 c．128G>T(p.G43V)(P7)，确诊1例22q13.3微缺失综合征(P1)、1例Angelman综合征(P2)、1例Sotos综合征2型(P4)、1例Smith-Lemli-Opitz综合征(P5)、1例11q24.1q24.2微重复综合征(P8)、1例15q21.3q22.2微缺失综合征(P9)及2例X连锁ID 2例(P6、P7)。 P4临床诊断为Sotos综合征。90%的Sotos综合征是由NSD1单倍体剂量不足(5q35微缺失或NSD1点突变)引起的，为Sotos综合征1型[7]。2010年发现NFIX突变可以导致Sotos综合征样表现(Sotos-like)，后命名为Sotos综合征2型(MIM #614753)，目前仅6例NFIX点突变导致Sotos综合征2型的病例被报道[8]。P4 FISH检测及靶向二代测序未发现包含NSD1基因的5q35区域的缺失/重复或NSD1点突变，发现NFIX c．613C>T(p.Q205X)新生杂合无义突变，生物学分析提示突变有害，结合患儿临床表现，P4 Sotos综合征2型基因诊断明确。此病例为国内首次报道NFIX突变导致Sotos综合征2型。 P8中度发育迟缓，视力差，语言发育明显延迟，有高热惊厥史，CMA发现chr11：123794665-127550567区域3756Kb单拷贝增加，父母此区域未见异常。chr11：123794665-127550567位于11q24.1-24.2，此区域包含多个与脑发育相关的OMIM基因，临床可表现为发育畸形、智力障碍。DECIPHER数据库(https：//decipher.sanger.ac.uk/)中有3个患者(#300792、#248786、#255590)11号染色体的重复区域与P12有重叠，临床主要表现为发育迟缓、发育畸形等，综上考虑患儿CNVs有致病意义。 本研究ID/DD总病因诊断率为26.7%(8/30例)。染色体核型诊断阳性率为4.5%(1/22例)，低于国外报道的9%～36%[1]，可能与我国染色体核型分辨率较低有关。MLPA、基因Panel诊断阳性率分别为6.7%(2/30例)和13.3%(4/30例)，与文献报道的4%～10%[9,10]和11%～25%[11,12,13]基本相符。CMA诊断阳性率为28.6%(2/7例)，高于文献报道的平均诊断阳性率12%[1,14]，可能与芯片不同及样本量较少有关。 本研究按照病因学诊断流程对30例原发性ID/DD患儿进行临床及遗传学分析，明确8例患儿的病因学诊断，发现4种基因的5种未报道的新突变，扩大了NFIX、DHCR7、UPF3B、DLG3基因突变谱，同时在国内首次报道1例NFIX突变导致Sotos综合征2型。染色体核型、MLPA、目标基因靶向捕获-高通量测序、CMA的诊断阳性率分别为4.5%(1/22例)、6.7%(2/30例)、13.3%(4/30例)、28.6%(2/7例)。规范化的病因学诊断流程有助于提高原发性ID/DD的病因诊断率。 |
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