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对于基因敲除（gene
knockout）小鼠大家并不陌生，比如我们想要研究一个基因在体内的功能，我们就可以把这个基因从小鼠体内敲除掉。而有的时候我们除了关心一个基因的功能外，还想知道表达这个基因的细胞在体内是干嘛的。比如，我们想知道B细胞是干什么的，胰岛细胞是干什么的？我们可以从小鼠体内把这些细胞清除掉（也叫细胞剔除，cell depletion），一看不能产生新抗体了，或是胰岛素没了，血糖升高器官衰竭了，我们就可以恍然大悟说：“你看，胰岛细胞是产生胰岛素的，B细胞是产生抗体的”。然后就可以发文章到CNS（Cell, Nature, Science）了。当然这些都被别人发现过了，是我们没有赶上好时代呀。
那怎样才能在体内把一群细胞清除掉呢？方法可能很多，但也真不多。这里我讲一个非常简单的方法，就是白喉毒素介导的细胞剔除。白喉毒素（Diphtheria toxin,
简称DT）大家可能知道，很多小孩子得过白喉blabla。DT这东西通过跟细胞表面一种叫白喉毒素受体（DT receptor，简称DTR）的蛋白结合，然后这个毒素就被带进了细胞内，再然后就通过据说是抑制蛋白合成还是什么机制把细胞废掉。但这种DTR只在灵长类（比如人呀，猴呀）有，小鼠等啮齿类动物没有。也就是说你给小鼠注射一大堆DT进去，小鼠也依然安然无恙。所以就有聪明人想，可以让小鼠某些细胞表达DTR，然后给小鼠注射一针DT就可以把这种有DTR的细胞干掉，也就是我题目讲的细胞清除。如果在给DTR加一个标签（EGFP），这样还可以看看到底哪个细胞绿了（EGFP），再给小鼠肚子上来一针DT，piapia，绿细胞不见了。多神奇呀。这种方法最早是被用来剔除树突状细胞（dendritic cells,
简称DC）（2002年）。Jung等将DTR-EGFP这个融合蛋白放在DC细胞特异分子CD11c启动子控制之下，做了一个转基因小鼠。注射一针DT之后，DC真的不见了。然后发在了一个叫Immunity的杂志上。这样后来人就用它来研究DC细胞在体内do what啦。后来这个DTR-EGFP融合蛋白基因又被用来剔除巨噬细胞（CD11b）(Duffield JS)，Lgr5肿瘤干细胞（如果真有的话）（Tian H, et al）和调节性T细胞(FoxP3)（Rudensky A. et al.）。关于这个剔除调节性T细胞。想当年我也做了这个FoxP3-DTR-EGFP，做出来比Rudensky实验室还早呢，但是愣是被他们先发了，从此也奠定了我彻底离开学术界的不归路。
为了使这个DTR用途更广，有人把它放在了Rosa26启动子下（Buch T, et al.），叫Rosa-iDTR小鼠。其实是在Rosa26启动子跟DTR之间放了一个loxP-STOP-loxP（Rosa26-loxP-STOP-loxP-DTR）。正常情况下，这个小鼠里哪个细胞都不会表达DTR，因为在Rosa26启动子和DTR之间有一个大大的”STOP”，Rosa26启动子够不到DTR。可是当这个小鼠跟Cre小鼠结婚生子之后，小鼠仔们哪个细胞有Cre，哪个细胞就会有DTR，因为Cre这把剪刀把“STOP”移走了，这样Rosa26启动子就够到了DTR（Rosa26-loxP-DTR）。这个时候再给小鼠DT，DT杀哪个细胞就完全看Cre在哪个细胞了。
我自己是学免疫的。尽管有人可能不同意，我自个儿还是觉得免疫学的核心问题是一种叫“免疫记忆”的东西。比如天花，人接种之后一辈子也不再得了。而有些疫苗接种之后几个月就不保护了；更有甚着有些家伙根本引不起免疫记忆，当然也不可能用它来做疫苗了。尽管免疫学研究已经有上百年的历史了，但直到现在我们对于免疫记忆的起始、维持和消亡的分子机制也很不了解。当然也有人说自己特别了解的，就像很多神父说了解圣经里的每一句话。但当你问他蛇在引诱夏娃吃那个水果之前是怎么走路的时候，他可能真不知道。
如果了解了免疫记忆的机制，就可以更好地设计疫苗，增强人民体质，进而保家卫国。我在读博士的时候就对这个大课题特别感兴趣，然后做博士后开始研究模式动物，觉得可以对免疫记忆做些研究了，当然最后我不成功。当时还没有rosa-iDTR（这个小鼠没有EGFP）的时候我就想，如果我做一个Rosa-iDTR-EGFP小鼠，然后做无数的Cre小鼠，这样我就可以把细胞一群一群的杀死，就可以知道哪些细胞对免疫记忆有帮助。举个例子吧，假如说表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关系，那我可以做一个IL6-Cre小鼠，然后跟Rosa-iDTR-EGFP小鼠交配。得到的小鼠先用病毒感染一次，这个时候只要是曾经表达过IL-6的细胞都是绿色的，并且都带有了DTR。这样我可以把EGFP阳性的细胞分离出来，转到另一只小鼠里，看是不是可以把免疫记忆带过去。或是在第二次病毒感染之前，先给小鼠来一针DT，这样只要是曾经表达过IL-6的细胞就都被干掉了，然后再看是不是把免疫记忆也顺带给干掉了。如果结果真是这样，至少可以说明表达IL-6的细胞跟免疫记忆有关，咱再往下研究就是了。哇塞，那个时候我发财了，至少发一篇超过15分的文章有可能吧。当然恰好是IL-6的可能性不是很大。但我可以把所有的细胞因子全做成cre小鼠呀，是不是成功的可能性就大起来了呢？很可惜我的博士后生涯结束了，做一个小公司，也可以把这个做出来呀。
公司一旦能够开始做基因敲除小鼠了，我就想终于可以开始把这个模型做出来了。下面就是设计思考怎么做了。通过我自己的经验和发表的文章，这个DTR-EGFP融合蛋白信号特别弱。如果比较一下CD11c-EYFP跟CD11c-DTR-EGFP;
或是FoxP3-EGFP和FoxP3-DTR-EGFP，信号强度简直是一个天上一个地下。说明这个DTR和EGFP互相处不好。所以我就想对这个做一个改造，把DTR-EGFP融合蛋白做成DTR-2A-EGFP，这样这俩哥们一起被表达出来，但表达完就分开了，互不干扰。这个时候就可以把DTR-2A-EGFP放在rosa26位置了。且慢，还不行。因为Rosa26启动子太弱了，即使是用EYFP单基因，阳性跟阴性也只有不到一个log的区别。把DTR-2A-EGFP放那里，谁知道是不是能够看到EGFP信号呀。所以我们想可以放一个强启动子，于是我们选择了pCAG启动子，这家伙不但动力强劲，而且是放哪儿都混不吝。也就是文言文里说的ubiquitous。这样就开始做一个叫做pCAG-loxP-STOP-loxP-DTR-2A-EGFP(简称pCAG-iDTR-EGFP吧)的工具鼠。
我得意呀，觉得可以找一批人做免疫记忆了。但我们的投资人给了我当头棒喝，说不能把公司做成研究所。做公司了还老想着科研，简直就是婚姻里找小三儿，必须坚决悔改，主要是改。也就是做公司必须以盈利为目的。我绝望了一阵，然后想，既然不让我自己做，我也可以给别人呀。他们发文章，然后说老鼠是我们这里来的，说不定谁还把我名字挂在他们文章里，也挺美的呀。
去年9月这个小鼠出来了，先把种群扩起来，从一个到几十个。然后就想得到的小鼠跟我预期的是不是一回事儿？于是我们把它跟一个免疫细胞特异基因（CD19）的cre小鼠交配，年前得到了一只CD19-Cre/pCAG-iDTRGFP小鼠。因为只有珍贵的一只，所以先采血看看是不是有GFP信号。答案是有，还不错（Fig 1a）。至少是目前为止看到的DTR-EGFP中信号最好的。下面就是要看DT是不是可以把这群EGFP细胞给杀死。只有一只小鼠，也没有对照，咱也不能直接一针进去，还没有个重复。所以我们就把这个小鼠的脾脏个取出来，然后把它的所有细胞洗吧洗吧再转到另外几只小鼠之中，这个时候再注射DT。24小时候，采点血看看见分晓了。没有注射DT的小鼠，EGFP阳性细胞还在；注射DT的小鼠呢，EGFP阳性细胞不见了（Fig 1b）。说明这个小鼠是成功的。
那这个工具鼠怎么用呢？海了去了。我列几个我自己感兴趣的。
比如我想研究I型糖尿病，我就可以把这个小鼠跟胰岛细胞特异的Cre小鼠交配，然后所有胰岛细胞都是绿的。然后注射DT就可以让beta细胞仙去，这个小鼠都没有胰岛素了，就得了糖尿病，当然这个是非常干净的I型糖尿病模型。刚出的973项目有个课题是研究I型糖尿病引起的继发性器官衰竭机制和干预的，这是一个多好的模型呀。比用STZ诱导干净多了。
当然我们是公司，没有资格申请这种高水平的国家大课题。现在细胞治疗很火。如果想做胰岛细胞移植治疗，研究者最担心的就是受体鼠本身beta细胞去不干净，还会再生。你把自己用ES/iPS好不容易分化出来的beta细胞打进去，检测胰岛素，不知道是自己打进去的beta细胞产生的呢，还是受体小鼠自身当初没有杀干净的beta细胞产生的。多影响情绪呀。如果用我们这个小鼠，你把自己的细胞漂红，小鼠的细胞是绿的，直接就可以用眼看。最不济还可以不断注射DT，让小鼠自己没有产生新胰岛细胞的机会。如果把这个小鼠跟NSG小鼠交配，说不定就可以直接研究从人iPS来的beta细胞的功能应用了，这是不是可以更快地上临床呢？
还有人想研究肝脏再生机制的。可以把这个小鼠跟albumin-cre小鼠交配，让所有肝细胞都变绿带DTR。再通过不同剂量的DT来杀死肝细胞，研究肝损伤多好呀。如果是NSG背景，不用做手术就可以做人鼠嵌合肝移植了。对药物研究多有贡献呀。
这个用途很广，想杀谁杀谁，完全看你不喜欢哪个细胞。管你是神经、癌症、心脏、肺脏的。当然还有我最欣赏的免疫细胞。如果有人想做免疫记忆的话，这个工具鼠就是真正找到了归宿。
现在种群不是很大，只有几十只，先给老客户，然后给不是客户的客户。我相信今后会有成百上千的文章是用这个小鼠做出来的。
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