视频讲座丨你要的qPCR引物设计已送达

GCBI讲堂-qPCR系列视频课的第一节课结束后，大家反响热烈，摩拳擦掌准备开始实验。实验开始的第一步就是:引物设计，大家都表示已经超级期待引物设计课啦。不舍得让大家久等，就是现在，qPCR系列视频课之qPCR引物设计课开讲了！

温故而知新，先一起来复习一下上节课的内容！

扩增曲线、Ct值指的是？

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扩增曲线：以循环数为横坐标，反应过程中实时荧光强度为纵坐标所做的曲线，通过该曲线可粗略判断扩增效率

Ct值：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数

如何对起始模板定量？

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通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析

实时荧光定量PCR常用方法是？

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QPCR常用方法可分为非特异性荧光标记与特异性荧光标记两类。非特异性荧光标记类是利用荧光染料（SYBR Green I）与双链DNA小沟结合发光的理化特征来指示扩增产物的增加；特异性荧光标记类是利用与靶序列特异杂交的探针(TaqMan 探针法和分子信标（molecular beacon）)来指示扩增产物的增加。

怎么样？还有疑问的同学可以点击链接复习一下哦→GCBI讲堂qPCR系列课-qPCR基本原理及应用

接下来的课程，孔老师会以染料法为例手把手教大家针对mRNA设计一对引物，包教包会，一堂课让你学会引物设计。

干货

来袭

引物设计

引物设计的目的:

找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板cDNA或DNA序列。而一对好的引物可以保证qPCR的特异性及高效性。

引物设计的要求：

1. 引物与模板序列要紧密互补

2. 引物与引物之间要避免形成稳定的二聚体或发夹结构

3. 引物与模板不能发生错配

根据这些要求，为了得到很好的引物对，在引物设计中要注意许多细节，比如说要控制引物的长度，扩增片段长度，引物序列中（G C）含量。

染料法（SYBR Green）引物设计的一般原则

·PCR扩增产物长度：100-200bp最为合适。

·引物长度一般为18-23bp，上下游引物不能相差太大。

·G C含量在40%-60%，50%-55%最佳。

·Tm值在58℃-61℃，最适60℃。上下游引物的Tm值不能相差太大。

·碱基要随机分布，尽量均匀。3’端不可修饰，而且要避开富AT、GC的区域，避开T/C或A/G连续结构（2-3个）。引物自身不能有连续4个碱基的互补，引物之间不能有连续4个碱基互补。引物末端碱基为G或C。

·一般设计2-3对引物可供选择，通过预实验选出最佳引物。

探针法探针设计的一般原则

·与染料法不同，探针法中设计引物的同时，还要进行探针设计。先设计探针，后设计引物

·探针的5'端第一个碱基不能是G，因为５‘G会有淬灭作用

·基因表达探针Tm值：68-70°C；基因分型探针Tm值：65-67°C

·TaqMan-MGB探针长度在13-25bp，TaqMan探针长度13-30bp

·避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G

·C比G多的探针效果更好，如果C少于G，选择其互补链

·多态位点应尽量位于探针中央，可以±3个碱基

探针法引物设计的一般原则

·引物尽可能地接近探针，但是不可与探针重叠

·引物长度9-40bp，最优20bp，GC含量保持在30-80%之间

·避免同一碱基重复过多，特别是连续4个或更多的G

·引物Tm值在58-60°C之间，上下游引物Tm不要超过2°C

·引物3’端的倒数5个碱基中，G和C加起来不要超过2个

·引物3’端不要是碱基A，避免出现3个以上相同碱基

·扩增片段的长度在50-150bp间，这样有利于使PCR效率相同

常用的引物设计在线工具的网址

Primer3 plus 在线引物设计：http:///cgi-bin/dev/primer3plus.cgi

SGD web Primer 在线引物设计：https://www./primer3

Primer bank 在线引物设计：https://pga.mgh./primerbank/

NCBI primer-blast在线引物设计及比对：https://www.ncbi.nlm./tools/primer-blast/

BathPrimer3.0 SNP基因分型引物设计：http://batchprimer3.bioinformatics./

ICG 在线内参引物网站：http://icg./index.php/Main_Page

课程预告

6月6日（周三）

qPCR检测与结果分析

*标准曲线

*扩增曲线

*溶解曲线

*拷贝数计算

*数据分析