干货：引物设计有妙招，有图有真相

PCR现在已经成为分子实验室的标配，无论是基因检测、基因定量、分子克隆、组装、突变、测序等等，都离不开PCR技术。在PCR过程中，引物设计是非常重要的一环，特别是qPCR的引物设计，决定了我们扩增效率是否达标和扩增产物是否特异。今天小编为大家举个例子，设计一对qPCR引物。

qPCR引物设计，通常要留意以下几点：

GC含量50%-60%

Tm值50℃-65℃

上下游引物尽量接近

引物末端最好是G或C

避开二级结构复杂区域

引物尽量在目的基因的3’ 端

引物尽量跨越内含子

目的基因是否有不同的剪切变体

……

这么多要注意的怎么办？！Primer-blast相信很多小伙伴们都用过，只要输入序列设置条件就可以设计得到理想的引物序列了。但是很多情况下，我们的要求往往不仅于此。下面，我们以人的EGFP（Epidermal growth factor receptor，表皮生长受体因子）基因为例，设计一对可以同时扩增其不同剪切变体的qPCR引物！

 

1. 查询基因结构

之前小编已经为大家介绍了如何利用NCBI查询基因结构了（错过了可以戳这里）， 首先查询Homo EGFP的基因结构：

 

2. 确定设计引物位置

可以看到，这个基因有多种不同的转录本，而前8个外显子区域是完全一致的（绿色小竖线）。我们的目的是将不同的转录本都扩增出来，那将反向引物设在第8个外显子之前就可以实现了。

 

3. 找到mRNA的序列号，进入GenBank

在该页面里继续往下拉，找到mRNA和蛋白质的GenBank序列号。点击mRNA的序列号，进入GenBank。借助Highlight Sequence Features，我们可以快速确定第8个外显子的位置。

 

4. 确定下游引物设计位置

点击Highlight Sequence Features后，浏览器的下方就会出现选项，选择查看Exon，找到第8个外显子，这样就能快速定位了。我们确定了第8个外显子到下游至1236bp为止。

确定下游位置后，点击Pick Primers，就能直接进入Primer-Blast的页面进行引物设计了。

 

5. 设计引物

由上一步我们知道了第8个外显子的位置至第1263 bp结束，那我们设计引物时，反向引物的位置不超过1263 bp。另外，qPCR的产物大小一般不超过300 bp，并且退火温度设置在57℃-63℃的范围内，跨外显子的设计有助于辨别基因组DNA的污染……设置好这些参数后，我们就可以点击Get Primers呢。

这时，NCBI就会弹出来告诉你，这样的参数选择会扩增到其他剪切变体，我们勾选不同的剪切变体并提交，就可以获得合适的引物对了！这些引物对的退火温度，都在60℃左右。根据实验目的，选择特异性好和引物自身互补越少的引物进行实验，成功率还是相当高的呢！

 

6. 引物特异性验证

其实，Primer-Blast除了可以设计引物外，还可以对我们自己设计的引物进行评价。返回引物设计的页面，输入我们设计好的上下游引物，其它参数可以不调整，提交后，NCBI就会告诉我们这对引物的情况了！

相当方便有木有啊～科研小白，受到引物设计的“神圣洗礼”后，终将修炼成为PCR达人。

来源：GenStar