乳腺癌HER2检测指南（2014版）

　　正确检测和评定乳腺癌的HER2蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重要。HER2检测结果不仅涉及患者是否适合针对HER2的靶向治疗，并且对内分泌治疗、化疗方案的选择及预后评估起指导作用。2006年我国《乳腺癌HER2检测指南》的发布。

　　对提高乳腺癌HER2检测水平起到了积极作用。2009年我因病理学家再次发布了《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》，强调了HER2检测结果的判读标准、检测的技术路线、内部及外部质量控制等，进一步推进了我国乳腺癌HER2检测的标准化。近年来针对HER2阳性乳腺癌的曲妥珠单抗在临床取得了较好疗效。

　　新药如拉帕替尼、帕妥珠单抗、T-DMl等也逐渐被用于临床。与此同时，HER2捡测中也出现了一些新的问题。2013年，美国临床肿瘤学会／美国病理医师学院（ASCO／CAP）公布了在2007版ASCO／CAPHER2检测指南基础上的更新版本。本指南结合我国实际情况，在《乳腺癌HER2检测指南（2009版）》的基础上，补充相关领域的新内容和新观点，旨在进一步提高HER2检测的可重复性和准确性，更有效地评估乳腺癌患者的预后，为患者的个体化治疗提供依据。

一、检测方法

　　推荐采用免疫组织化学（IHC）法检测HER2受体蛋白的表达水平，应用原位杂交（lSH）法检测HER2基因扩增水平。ISH包括荧光lSH（FISH）和亮视野ISH。常用的亮视野ISH方法有显色ISH（CISH）和银增强ISH（SISH）。本指南推荐IHC与ISH相结合的检测策略。

二、检测时机及临床病理联系

　　所有乳腺原发性浸润癌都应进行HER2检测。只要能获取肿瘤组织，对复发灶或转移灶也应该进行HER2检测。如HER2检测结果为不确定，则应使用另一种检测方法进行检测，或对该患者的其他样本进行检测。加强临床病理沟通有助丁对HER2检测结果的正确诠释和对HER2靶向治疗疗效的客观评价。

　　临床医师和病理医师均需注意HER2检测结果是否与组织病理学特征相符，如组织学分级为l级的浸润癌通常为HER2阴性，包括浸润性导管癌、经典型浸润性小叶癌、小管癌、黏液癌、筛状癌、腺样囊性癌等。如检测结果为阳性，则视为检测结果与组织病理学特征不符合，需要核实诊断或重新检测。

三、HER2检测流程

　　乳腺癌标本一般可先经IHC检测。IHC3+为HER2阳性，IHCO和l+为HER2阴性。IHC2+为HER2不确定病例，需进一步应用ISH的方法进行HER2基因扩增状态检测，也可以选取不同的组织块重新检测或送条件更好的实验室进行检测。

四、组织标本的制备

1.标本类型：（1）手术切除标本；（2）粗针穿刺活检标本；（3）麦默通活检标本。

2.标本固定：所有乳腺癌标本离体后都应尽快固定（1h内）。固定时应将标本每隔5～10mm切开，并可在组织间嵌入纱布或滤纸等物。固定液量与所浸泡组织的比例应足够。固定时间以6-72h为宜。

3.固定液类型：4％中性（磷酸缓冲）甲醛固定液。

4.组织切片：（1）未染色的切片置于室温不宜超过6周，以防抗原丢失。（2）用于IHC染色者切片厚度以3～5um为宜，ISH法以4~5um为宜。（3）完成检测的切片，IHC和亮视野ISH可按常规长期保存，FISH结果应立即照相存档并于-20℃保存，建议至少保存3个月备查。（4）各种检测方法均应有HE染色切片作为对照。

五、染色要求与结果判读

　　建议使用我国食品药品监督管理总局认证的检测试剂盒，对自行组配的检测系统则必须经过严格的内、外部质量控制，建立完善的实验室标准操作程序（SOP），并与权威机构批准的梭测试剂盒进行比对，以保证检测结果的可靠性。

（一）IHC
1.观察程序：应先在低倍镜下观察整张切片，判断染色是否满意及是否存在HER2表达的异质性。正常乳腺上皮不应出现强的细胞膜着色。只评定浸润癌的着色情况，导管原位癌的着色不能作为评定对象。观察细胞膜着色的浸润癌细胞的比例及着色强度，若出现细胞质或细胞核着色提示IHC染色效果不理想或组织处理不佳，建议调整染色条件或更换组织后再行染色。判读时应避开组织边缘及组织处理不佳（如明显挤压）的癌组织。

2.结果判读及注意事项：结果判读标准（按每张切片计；图1，2）：O：无染色或≤10%的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；1+：〉10％的浸润癌细胞呈现不完整的、微弱的细胞膜染色；2+：有两种情况，第一种为〉10%的浸润癌细胞呈现不完整和／或弱至中等强度的细胞膜染色，第二种为≤10％的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色；

3.10％的浸润癌细胞呈现强而完整的细胞膜染色。对于2+的病例，应该用ISH做进一步检测，也可以选取不同的组织块重新检测或送条件更好的中心实验室进行检测。当出现下列情况时HER2状态为无法判读（indeterminate），包括标本处理不当、严重的组织挤压或边缘效应、检测失败等。

　　应在报告中注明HER2状态无法判读的可能原因，并建议再次获取样本进行HER2检测。在乳腺浸润性微乳头状癌和部分有分泌现象的乳腺癌中，有时浸润癌细胞的细胞膜已呈很深的棕褐色，但却并未呈闭环状完整着色，存在一定程度的不连续性和间断性，此时至少应视为HER22+，并需要行ISH检测进一步明确HER2状态。

　　建议在HER2IHC检测报告中包括如下内容：患者信息（包括姓名、性别、年龄、门诊／住院号）、送检医师姓名、送检日期、标本信息（包括病理号和蜡块号）、标本部位和类型、抗体信息（克隆号／生产商）、检测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果（0、1+、2+、3+）、检测结论（如阳性、不确定、阴性、无法判读）。

3.质量控制：包括抗体的选择、抗原修复方法、染色及其他相关实验室技术，均应严格按SOP进行。IHC自动染色系统更易达到标准化，但也应进行严格的比对试验和程序优化，且需要对机器进行定期维护。IHC染色须设立对照，以不同染色稃度的组织芯片作为对照为最佳。被检测切片中癌旁正常乳腺下皮细胞是很好的阴性内对照。利用计算机图像分析有利于判断的准确性和可重复性，但必须经过病理医师确认其结果，且设备使用前必须进行校验。

（二）FISH

　　FISH技术通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA靶序列杂交。在荧光显微镜下观察并分析细胞核内杂交于DNA靶序列的探针信号，以获得细胞核内染色体（或染色体片段）上基因状态的信息。目前进行HER2基因状态检测的探针多为同时含有HER2基因和该基因所在的第17号染色体着丝粒（CEPl7）序列的双探针，也可采用仅含有HER2基因的单探针。

1.观察程序：应在低倍镜下观察整张FISH切片，初步判断检测质量以及是否存在HER2扩增的异质性。要求至少找到2个浸润癌区域，汁数至少20个浸润癌细胞。也可以参照IHC切片先确定可能存在扩增的浸润癌区域，然后于100倍物镜下通过特异通道滤光片观察HER2和GEP17信号，并进行信号计数和比值计算。

2．结果判读及注意事项：应选择细胞核大小一致、核的边界完整、二脒基苯基吲哚（DAPI）染色均一、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中的双色信号。在观察信号时，应根据情况随时调节显微镜的焦距，准确观察位于细胞核不同平面上的信号以免遗漏。

　　判读标准（网3～5）：双探针ISH：（1）当HER2／CEPl7比值≥2.0时，为HER2阳性；HER2／CEP17比值〈2.0，但平均HER2拷贝数／细胞≥6.0时也为HER2阳性。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上。需要注意的是对于HER2／CEPl7比值≥2.0，但半均HER2拷贝数／细胞〈4.0的病例是否应该视为ISH阳性目前尚存一定争议。建议对这部分病例在报告中加以备注，提示目前的认识争议，建议临床医师参考IHC检测结果并与患者进行必要的沟通。

（2）HER2／CEPl7比值〈2.0且平均HER2拷贝数/细胞＜4.0时为HER2阴性。（3）HER2／CEPl7比值〈2.0且平均HER2拷贝数／细胞〈6.0，但≥4.0时为HER2ISH结果不确定。单探针ISH：肿瘤细胞平均HER2拷贝数/细胞4.0为无扩增；肿瘤细胞平均HER2拷贝数/细胞≥6.0为狂增。扩增细胞应均质、连续，且占浸润癌的10％以上。

　　平均HER拷贝数／细胞在4～6之间为不确定。若众多HER2信号连接成簇时可不计数，直接视为基因扩增。对于ISH结果不确定的病例，需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位分析者重新计数。如仍为临界值，则应行IHC检测（若FISH前未行），也可以选取不同的组织块重新检测。

　　建议存HER2FISH检测报告中包括如下内容：患者信息（包括姓名、性别、年龄、门诊／住院号）、送检医师姓名、送检日期、标本信息（包括病理号和蜡块号）、标本部位和类型、探针信息、捡测方法、是否使用图像分析、对照设置情况、样本量是否适合评估、判读结果（包括评估的细胞数量、平均HER2拷贝数／细胞、平均CEPl7拷贝数／细胞、平均HER2拷贝数／平均CEPl7拷贝数的比值）、检测结论（如阳性、不确定、阴性、无法判读）。

3.质量控制：（1）内对照：使用上述同时含有HER2基因和CEP17序列的混合探针时，组织中≥75％的细胞核显示出双色信号时视为杂交成功，并且双色信号互为对照，癌与非癌细胞互为对照。出现下列情况时应视为FISH检测失败，包括：①对照样本未出现预期结果；②浸润癌病灶太小，难以观察到两个浸润癌区域并计数；③可计数信号的细胞〈75％；④＞10％的荧光信号位于细胞核外；⑤细胞核结构难以分辨；⑥有强的自发荧光。

（2）外对照：成选择已知FISH阳性和阴性的标本片（或采用厂家提供的对照片）作为外对照，且杂交染色结果与预期相符。（3）如有町能，建议设置低扩增对照。

4.关于第17号染色体数目：FISH双探针检测中加入CEPl7探针的目的是为了在检测HER2基因的同时检测第17号染色体数目，从而将第17号染色体的非整倍体和单纯的HER2基因扩增，尤其是低水平的扩增区分开。但近年来的研究显示整条第17号染色体的多体罕见，CEP17的多体并不能代表整条第17号染色体多体。

　　部分乳腺癌中第17号染色体存在HER2基因和着丝粒的共同扩增。越来越多的学者认为，与HER2／CEPl7比值相比，HER2拷贝数对于HER2基因扩增的判断更为重要。因此在HER2FISH检测结果中除报告HER2／CEP17比值外，还应分别报告HER2拷贝数和CEPl7的数值。

5.关于HER2基因的异质性：浸润性乳腺癌中HER2表达或扩增可存在异质性。虽然HER2基因异质性的临床意义目前仍不明确，但它可导致IHC与ISH检测、原发灶与转移灶、穿刺标本与手术切除标本的检测结果不一致。在ISH计数之前，应观察整张切片或使用IHC确定可能存在HER2扩增的区域。

　　需要强调的是，即使存在异质性，但只要扩增细胞连续、均质，且占浸润癌10％以上，就应明确报告为ISH阳性。可补充报告不同细胞群（〉10％）的计数值（包括计数的细胞总数、HER2拷贝数、CEPl7数值、HER2／CEP17比值），并报告扩增细胞群占所有浸润癌细胞的比例。

（三）SISH

　　SISH中目前运用最广泛的是双色银染ISH（DISH）。在此检测中通过二硝基苯（DNP）标记的探针检测HER2，并利用银染ISHDNP染色液进行显色。用地高辛标记探针检测CEP17，采用地高辛红染显色液。DISH可在光镜下观察结果，其中HER2在肿瘤细胞的细胞核中表现为黑色信号，CEP17为红色信号。也可采用仅针对HER2基因的单探针SISH。

1.观察程序：结合HE染色。选定含有浸润性乳腺癌的靶区进行观察。选定区域内的大部分细胞需同时显示黑色和红色信号，且这些信号没有被非特异性背景染色覆盖。计数至少20个浸润癌细胞。在4倍物镜下扫描整张切片，观察是否存在HER2表达的辟质性以及标本质量。然后于高倍镜（40倍或60倍物镜）F观察结果并进行信号计数和比值计算。

2.结果判读（图4～6）：（1）应选择细胞核大小一致、核的边界完整、细胞核无重叠、红色和黑色两种信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中的双色信号。

（2）当存在HER2信号簇时，可根据单个拷贝大小估计拷贝数。判读标准：参见FISH，如果最终结果为不确定，则需要再计算20个细胞核中的信号或由另外一位分析者重新计数。如结果仍为不确定，则应行IHC检测（若SISH前未行），也可以选取不同的组织块重新检测。报告格式可参照FISH检测。

3.质量控制：（1）内对照：可以乳腺组织中的正常细胞（如成纤维细胞、血管肉皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细胞）的HER2信号和CEP17信号作为内对照。出现下列情况时应视为检测失败，包括：①对照未出现预期结果；②难以观察到至少两个浸润癌区域并计数；

③缺乏红色染色或黑色染色；④斑点伪影干扰计数；⑤严重消化过度或细胞核中空泡干扰计数；⑥非特异性背景染色强，干扰计数。（2）外对照：建议在每次染色过程中都加入阳性和阴性对照，以用于确认试剂质量和仪器功能。

（四）CISH

　　在CISH检测中多使用地高辛标记的探针，在石蜡切片上进行ISH反应，再用鼠抗地高辛-抗体和辣根过氧化物酶，抗鼠抗体进行免疫结合，二氨基联苯胺显色后，在普通显微镜亮视野下观察HER2基因信号。也有关于双探针CISH的报道。CISH检测可以同时显示基因状态与组织形态学，且检测切片可长期保存。

1.观察程序：结合HE染色，选定含有浸润性乳腺癌的靶区进行观察，区域内的大部分细胞需有棕色信号，阻这些信号没有被非特异性背景染色覆盖。计数至少20个浸润癌细胞。在低倍镜下观察整张切片，确定标本质量及是否存在HER2张增的异质性。然后于高倍镜（40倍或60倍物镜）下进行信号计数。

2.结果判读（图4，5，7）：（1）应选择细胞核大小一致、核的边界完整、细胞核无重叠、信号清晰的细胞。随机计数至少20个浸润癌细胞核中的HER2信号。（2）判读标准：参照FISH。如果最终肿瘤细胞平均HER2拷贝数／细腿〈4．0为无扩增；肿瘤细胞平均HER2拷贝数／细胞≥6.0为扩增。

平均HER拷贝数／细胞在4～6之间为不确定。如果最终结果为不确定，则需要再计算20个细胞梭中的信号或由另外一位分析者重新计数。如结果仍为不确定，则应行IHC检测（若CISH前未行），也可以选取不同的组织块重新检测。报告格式可参照FISH检测。

3.质量控制：（1）内对照：可以乳腺组织中的正常细胞（如成纤维缁胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、正常乳腺上皮细胞）的HER2信号作为内对照。出现下列情况时应视为检测失败，包括：①对照朱出现预期结果；②难以观察到至少两个漫润癌区域并计数；③缺乏细胞核内的棕色信号；④严重消化过度或细胞核中空泡干扰计数；⑤非特异性背景染色强，干扰计数。

（2）外对照：建议在每次染色过程中都加入阳性和阴性对照（可采用厂家提供的质控对照片），以用于确认试剂质量和仪器功能。

六、实验室要求

　　HER2蛋白和基因扩增的检测均应在内、外部质量控制良好的病理实验室进行，必须严格按照指南要求的程序操作，以保证结果可靠。不具备HER2检测条件的单位应按照指南规定妥善地准备好标本，提供给有质量保证的病理实验室进行检测。

实验室内、外部质量控制和SOP的主要要求如下：

1．准备开展乳腺癌HER2检测的实验室有责任确保其检测结果的可靠性和准确性。无论哪一种检测方法的开展均需要通过严格的比对验证，也可通过参加有关外部质量控制活动（建议每年进行1～2次）来实现。

2.内部质量控制T作包括定期对相同组织的不同批次染色结果进行重复性分析，每次染色阳性、阴性对照的设置，如有可能还应设置低表达／低扩增对照。检测相关的仪器和设备需定期维护、校验。

3.应建立完善的SOP，并做好检测情况的记录和存档工作。

4.任何操作程序和试剂的变化均应重新进行严格的比对验证。

5.从事乳腺癌HER2检测的实验技术人员和病理医师应进行必要的培训和资格考核。

　　总之，准确的HER2检测是患者得到正确治疗的基石。HER2检测的影响因素贯穿在检测前、检测中及检测后的多个环节，规范化的操作程序和标准化的结果判读能提高HER2检测的准确性和可重复性。在HER2检测过程中一定要重视多学科合作的重要性，加强临床与病理的交流沟通有助于对HER2梭测结果的正确诠释及对治疗疗效的客观评价。

免责声明：本指南只代表本编写组观点，供各临床病理实验室结合各单位实际情况参照使用。本编写组不对因使用本指南而引起的直接或间接损失承担任何责任。

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