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摘要：微生物代谢物可以调节宿主的免疫反应。短链脂肪酸（SCFA）是肠道膳食纤维微生物发酵的主要代谢产物，它影响局部和全身免疫功能。在这里，我们发现SCFA是体内破骨细胞代谢和骨量的调节因子。给小鼠SCFA或者是高纤维饮食都能显著增加骨量，防止绝经后和炎症引起的骨丢失。SCFA对骨量的保护作用，与其能在体内或者体外都能抑制破骨细胞的分化和骨吸收功能有关，然而SCFA对骨形成没有影响。丙酸酯(C3)和丁酸酯(C4)诱导破骨细胞代谢重排，导致糖酵解增强而氧化磷酸化减弱，由此下调了关键的破骨基因如TRAF 6和NFATC 1。总的来说，这些数据表明SCFA是破骨细胞代谢和骨稳态的有效调节因子。 背景：据报道，短链脂肪酸具有免疫调节能力。因为免疫激活又与骨稳态密切相关，所以我们假设SCFA可能影响骨内平衡，从而为肠道微生物和骨之间提供了直接的机制联系。最近的研究表明，或许存在特定的细菌种类会影响包括类风湿关节炎和强制性脊柱炎在内的炎症性骨病的发生。结果表明，富含纤维的膳食是scfa的主要发酵来源，能改善RA患者的骨破坏。这些观察促使我们研究在稳态条件下SCFA对骨骼的作用以及在更年期和炎症期间对病理性骨丢失的影响。研究数据表明不同微生物暴露的小鼠会产生不同的表型。因此，我们测试了肠道微生物区系的分泌代谢物，而不是微生物区系本身是否可以解释这些差异性效应。为了验证这一假设，我们使用了三种独立的实验方法：（1）直接补充SCFA（2）高纤维饮食（HFD）（3）细菌转移。作者发现在稳态和绝经后骨代谢中一致的有益效应与SCFA水平高度相关。SCFA的来源和生物学功能与长链脂肪酸有本质的区别，后者影响胰岛素的代谢，影响骨骼的生长。 在这两种炎症性关节炎模型（CIA,SIA）中，SCFA（C3和C4）对骨稳态和减轻疾病有积极的作用。在分子水平上，SCFA对骨稳态的直接影响依赖于破骨前细胞的早期代谢重组。此外，通过诱导调节性T细胞，SCFA诱导的免疫抑制机制也有助于炎症的减弱。因此，我们的发现表明SCFA在骨代谢和免疫反应中起着至关重要的作用，减轻了关节炎的严重程度。 结果： （1）SCFA和HFD提高全身骨密度 （1）SCFA和HFD提高全身骨密度 ①小鼠直接给SCFA 发现SCFA处理组小鼠血清SCFA浓度显著升高。 Fig. 1a–c： SCFA治疗显著增加骨量，表现为骨组织体积增加(BV/TV)和小梁间隙减少(Tb-Sp)。 Fig. 1d：CTX-I（骨吸收标志物）血清水平显著下降。 由于SCFA对免疫细胞起作用，特别是诱导Treg。作者在给予小鼠SCFA治疗后，分析了脾脏中Treg发现其数量有所增加，然而除了影响IL-10、IFNγ、TGFβ和TNFα水平，血清细胞因子水平并没有什么变化。 接下来作者用RAG1-/-小鼠：分四组处理8W。正常饮用水组，分别含C2，C3， C4的饮用水。 Tregs的增加可能解释了SCFA的骨效应，因为Treg可以抑制破骨细胞和增加骨量。为了排除这种可能性，我们用SCFAs治疗RAG1-/-小鼠（让T、B细胞停留在前体细胞，因而免疫缺陷），并观察到BV/TV的增加以及骨小梁间隙（Tb. SP.）和破骨细胞数的减少。 在C2处理后，RAG1-/-小鼠的破骨细胞数量没有减少，而是指向不同的抑制机制。 ②健康人补充丙酸钠(Propicum)
我们研究了富含可发酵的、难以消化的纤维的饮食对骨骼是否有类似的作用，这些纤维能提高盲肠和血清中的SCFA水平(图1L和补充图1g)。与直接补充SCFA一致，为期8周的富含纤维的饮食(补充表1)导致骨量增加(图1m)，并减少小梁间隙(图1n)，这与破骨细胞数量和CTX-I血清水平下降有关(图1o和补充图1h)。同时，OCN血清水平和成骨细胞数保持不变(补充图1I，j)。虽然HFD治疗后Treg数也有所增加，但血清细胞因子水平并无明显变化(补充图1k，l)。值得注意的是，在饲养试验中，无论是SCFA还是HFD(补充图1m)，其增重均无差异。 ④特定细菌种类的转移和肠道微生物区系及其分泌代谢物的变化的影响
接下来我们将讨论特定细菌种类的转移和肠道微生物区系及其分泌代谢物的变化是否也会影响骨量。在早期RA中科普雷菌（Prevotella copri）丰度增强了。因此，我们将三种有代表性的来自普罗沃特拉属(Prevotella)菌种分别转移到WT小鼠中，并在8周后对全身骨量进行了分析。所有Prevotella spp.的转移显著增加破骨细胞数量(补充图1n)，并且Prevotella spp的相对丰度持续了8周(补充图1o，p)，但却减少了受体小鼠的SCFA水平(图1p)和全身骨量(图1q，r)。由此证明了疾病相关的微生物菌群改变和随其后的SCFA水平的改变对骨稳态的影响。细菌转移后骨量的这一变化似乎是特定于Prevotella spp的，这是因为在转移具有分类相关家族类杆菌科和木杆菌科的代表性细菌时却没有类似的变化（S. Fig. 1q）。 （2）SCFA改变破骨前体细胞的代谢状态（体外试验）
Fig. 2a, b：在体外，破骨细胞分化试验表明，浓度为0.03mM的 C2和0.015 mm C3或C4对破骨细胞分化有抑制作用。这一浓度范围是在SCFA喂养后的两个单独实验的骨髓液中发现的，即在调节测量值后，C3和C4的浓度分别约为0.4mm和0.15 mm。冲洗后的骨髓样本对重复测量的5.5±1.34l(n=5)骨髓液体积的测量结果(补充图2a，b) C2/C3/C4对破骨细胞分化和骨吸收的抑制作用与游离脂肪酸表面受体FFA 3(GPR 41)和FFA 2(GPR 43)无关(补充图2c，d)).
Fig. 2c–e：在RANKL刺激后早期时间点，C3和C4显著抑制两种关键的破骨细胞分化信号元件，TRAF6和NFATc1。虽然我们体内的数据显示SCFA对成骨细胞和骨形成没有影响，但C3和C4强烈抑制破骨细胞的分化。 细胞代谢控制着不同的细胞功能，在破骨细胞分化过程中发生了几种顺序的代谢变化。例如，从前体分化为成熟破骨细胞依赖于氧化磷酸化，成熟破骨细胞的骨吸收依赖于糖酵解。
Fig. 2f–i和S Fig. 2e：C3/C4刺激48h后能显著诱导破骨细胞前体糖酵解，但氧化磷酸化无变化。
S Fig. 2f, h值得注意的是，在单个Gpr41、GPR 43和GRP 41/43双敲除小鼠的破骨细胞试验中也观察到了这些代谢变化，尽管SCFA受体在破骨细胞上表达。
Fig. 2j：Westernblot分析C3和C4处理后AMPK激活后的 detect energy stress，发现pAMPK/AMPK比值较高。 这些结果表明，在破骨细胞分化的早期时间点(24~48h)，C3和C4使破骨细胞前体的代谢向糖酵解转变，这导致细胞应激，从而阻断破骨细胞分化。 （3）SCFA对绝经后骨丢失的保护作用
Fig. 3a–c：给予C3和C4有效预防OVX所致骨丢失。
Fig. 3d：在细胞水平上，我们观察到在C3和C4治疗后，OVX诱导的破骨细胞形成完全得到挽救。
S Figs. 3b and 2a：血清SCFA浓度显著升高，达到体外抑制破骨细胞分化能力的范围。 （4）SCFA能减轻关节炎，防止骨质流失 我们研究了SCFA和HFD在两种实验性关节炎模型（CIA和SIA）中的作用。
Fig. 4a, b：给予C3或C4治疗可明显减轻胶原诱导性关节炎小鼠模型炎症的严重程度。
Fig. 4c： C3/C4治疗后全身骨质量增加。
Fig. 4d, e：患足破骨细胞数量减少，血清ctx-i水平下降，成骨细胞数和ocn水平不变。
S Fig. 4a, b：血清SCFA浓度显著升高，但对增重无明显影响。
S Fig. 4d–h：值得注意的是，观察到的影响似乎与GPR43很大程度上无关，因为在给予GPR43−/−小鼠C3/C4治疗后，骨量基本保持不变并且能够抑制破骨细胞特异性基因。
Fig. 4h–j：Fig. 4k–m：在HFD喂养后CIA后，K/BxN血清诱导小鼠模型（SIA）和（胶原诱导性关节炎）小鼠模型观察到了类似的效应。
Fig. 4n–p：HFD喂养还可保护SIA小鼠模型中的炎性骨丢失
S Fig. 4i：SIA模型，血清SCFA浓度显著升高 总之，这些数据表明SCFA是破骨细胞代谢和骨稳态的有效调节因子。我们的发现表明SCFA在骨代谢和免疫反应中起着至关重要的作用，减轻了关节炎的严重程度。 参考文献： 1 Lucas S, Omata Y, Hofmann J et al. Short-chain fatty acids regulate systemic bone mass and protect from pathological bone loss. Nat Commun 2018; 9:55. 各位读者： |
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