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本文由静子编译，董小橙、江舜尧编辑。 原创微文，欢迎转发转载。 代谢综合征及其相关病症，例如肥胖，2型糖尿病（T2D），高血压（HBP）以及非酒精性脂肪肝是全世界关心的健康问题。代谢紊乱会导致肠道菌群组成的改变，但目前的研究对于代谢紊乱中肠道菌群功能的改变及其参与代谢紊乱的发病机制知之甚少。肠道菌群产生的色氨酸代谢物如吲哚是芳香烃受体（AhR）的配体，在肠道稳态中起到主要作用，并且参与炎症性肠病的发病机制。据报道AhR靶基因的激活在患有代谢综合征的小鼠中被改变，表明AhR可能参与了代谢综合征的发病机制；并且肠道菌群减少AhR配体色氨酸的产生参与了炎性肠病的病发。 本研究确定具有代谢综合征患者的粪便样品显示较低的色氨酸代谢物水平及AhR活性降低，而在代谢综合征模型中也观察到类似的AhR配体的缺失。采用AhR激动剂治疗或者是补充能产生丰富AhR配体的肠道菌株可补偿受损的AhR信号传导，减少葡萄糖代谢障碍和肝脏脂肪变性且代谢紊乱的改善和肠屏障功能的恢复可能与肠促胰岛素的产生相关。 论文ID 原名：Impaired Aryl Hydrocarbon Receptor Ligand Production by the Gut Microbiota Is a Key Factor in Metabolic Syndrome 译名：代谢综合征的关键因素是肠道菌群产生的芳香烃受体配体受损 期刊：Cell Metabolism IF：20.565 发表时间：2018年 通信作者：Harry Soko 通信作者单位：巴黎萨克雷大学，巴黎第六大学以及圣东安尼医院 实验设计 一、动物模型建立 1、高脂饮食（HFD）诱导的代谢综合征
6-7周龄的ob/ob小鼠及其野生型小鼠喂养标准饮食12周 所有小鼠的性别均为雄性。实验过程中每周称一次体重，每周记录每笼小鼠的食物消耗量。除了体内的肠渗透性实验，其余的小鼠在禁食6小时后用异氟醚麻醉后脱颈椎处理，并收集实验所需组织。 二、动物治疗 1、Ficz处理 腹腔注射6-甲酰基吲哚（3,2-b）咔唑（Ficz，1mg /小鼠）或空白溶剂DMSO，每周一次，持续12周。 2、罗伊氏乳杆菌的补充治疗 每天用含有109CFU的罗伊氏乳杆菌CNCM I-5022或者是空白溶剂（含有0.05%L-半胱氨酸和15%甘油的MRS培养基）灌胃，持续12周。 三、实验方案 1、粪便肠道菌群移植 2、荧光素酶法测定AhR活性 3、提取粪便肠道菌群的DNA，通过qPCR定量肠道菌群的丰度，并通过16s rRNA基因测序技术确定肠道菌群的组成 4、通过HPLC串联比色电极测定法测L-色氨酸和L-犬尿氨酸含量；通过UPLC-MS定量吲哚衍生物的含量。（吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO）活性=L-色氨酸/L-犬尿氨酸） 5、口服葡萄糖耐量试验（OGTT）和胰岛素耐受实验（ITT），根据梯形法计算两者的AUC 6、HOMA-IR=空腹血糖（nmol / L）×空腹胰岛素（microU / L）/22.5 7、采用Olympus AU400化学分析仪测定血浆胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白（HDL），谷草转氨酶（AST），谷丙转氨酶（ALT） 8、HE染色进行肝脏病理学检查 9、使用USSing chamber测定肠通透性 10、使用荧光素-葡聚糖（FITC-葡聚糖，4kDA）进行肠屏障功能的测定 11、用相应的ELISA试剂盒测定可溶性CD14（sCD14）、TNF-α以及IFN-γ的含量 12、用Caco-2细胞和反式上皮细胞电阻（TEER）进行肠屏障功能障碍的测定 13、用GLUTag的免疫测定评估GLP-1分泌 14、用RT-PCR定量mRNA含量 实验内容 1、代谢综合征患者的微生物代谢物和AhR活性均受损 如图1A-D所示，代谢综合征患者的AhR激动剂浓度显著低于非代谢综合征患者的AhR激动剂水平，且AhR激动剂水平随着BMI的升高而显著降低。而犬尿氨酸在机体内的表现则完全相反。代谢综合征患者粪便样品中的犬尿氨酸浓度显著高于非代谢综合征患者，且其与BMI呈正相关趋势。犬尿氨酸是色氨酸被细胞内的吲哚胺2,3-双加氧酶1（IDO）代谢产生的，并且是导致慢性炎症性疾病发展的关键因素（图1E-H）。为了研究色氨酸代谢物缺失的功能相关性，作者研究了不同个体的粪便样品在体外激活AhR的能力。与低水平的色氨酸代谢物一致的是，代谢综合征患者粪便样品中AhR激动剂活性显著低于健康受试者（图1I-L）。总的来说，这些临床数据表明代谢综合征患者中肠道菌群产生的AhR配体发生了改变，并且表明了其在代谢综合征发病机理中的潜在作用。 图1 代谢综合征患者的肠道菌群表现出AhR活性降低和较低的AhR激动剂水平 A:高BMI和低BMI者粪便样品中四种AhR激动剂（吲哚乙酸（IAA）、吲哚、3-甲基吲哚和色氨酸）的总浓度 B：BMI和粪便AhR激动剂浓度的皮尔森相关性分析 C和D: T2D和HBP患者与健康受试者粪便AhR激动剂浓度比较 E: 高BMI和低BMI者粪便样品中犬尿氨酸的浓度 F: BMI和粪便犬尿氨酸浓度的皮尔森相关性分析 G和H: T2D和HBP患者与健康受试者粪便犬尿氨酸浓度比较 I: 高BMI和低BMI者粪便样品中AhR活性测定 J: BMI和粪便AhR活性的皮尔森相关性分析 K和L: T2D和HBP患者与健康受试者粪便AhR活性比较 2、代谢综合征动物模型中肠道菌群组成改变以及其产生的AhR配体减少 为了研究肠道菌群产生的AhR配体改变与代谢综合征机理之间的关系，作者使用临床前的代谢综合征动物模型。和临床的结果一致，与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠结肠内容物中的AhR激动剂活性和肠道菌群产生的AhR配体的浓度显著降低（图2A-D）。HFD喂养的小鼠肠道AhR靶基因IL-22,Reg3g以及Reg3b的mRNA表达量显著降低（图2E-G），并且HFD喂养的小鼠结肠内容物中的总色氨酸含量也显著低于CD喂养的小鼠中总色氨酸的含量（图2H）。相反，IDO的活性以及犬尿氨酸含量在HFD小鼠中显著增加（图2I-J）。HFD喂养的小鼠肠道菌群中的毛螺菌科（Lachnospiraceae）和梭菌科（Clostridiaceae）以及变形菌（Proteobacteria phylum）相比较于CD喂养的小鼠相对增加，而来自理研菌科（Rikenellaceae）和双歧杆菌科（Bifidobacteriaceae）和阿克曼粘细菌（Akkermansia muciniphila）的丰度低于CD喂养的小鼠（图2L-M）。在HFD喂养的小鼠模型中以及采用遗传导致的代谢紊乱疾病的小鼠模型（瘦素缺失，ob/ob小鼠）中可观察到相似的结果，相比较于CD喂养的小鼠或野生型（WT）小鼠中，HFD喂养的小鼠以及ob/ob小鼠中AhR活性显著降低。（图2N-O）图二的结果表明了肠道菌群产生的AhR配体的减少是代谢紊乱的跨物种特征现象。 图2 HFD诱导的代谢综合征与肠道菌群组成的改变及受损的肠道菌群导致的AhR激活之间的联系 A:CD或HFD喂养12周后小鼠粪便中AhR激动剂活性的测定 B-D：CD或HFD喂养12周后小鼠粪便中吲哚乙酸（B）、吲哚（C）、色胺（D）的浓度 E-G: CD或HFD喂养12周后小鼠肠道IL-22（E）、Reg3g（F）、Reg3b（G）的mRNA表达 H-J: CD或HFD喂养的小鼠结肠粘膜中色氨酸浓度（H）、IDO活性（I）和犬尿氨酸浓度（J）测定 K: CD或HFD喂养的小鼠肠道菌群的主成分分析图 L: 在微生物门水平上进行粪便细菌的组成分析 M: CD和HFD组之间粪便肠道菌群的判别分析 N: CD或HFD喂养12周后粪便AhR激动剂活性的测定O：CD喂养的6周龄ob/ob小鼠及野生型小鼠粪便中AhR激动剂活性的测定 对于A-J，N，O，采用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验，以及用非配对t检验获MannWhitney检验进行统计学分析。数据用means ± SEM表示。 3、AhR激动剂治疗可缓解HFD诱导的代谢综合征 为了研究受损的肠道菌群AhR活性的生理重要性，将AhR激动剂6-甲酰基吲哚（3,2-b）咔唑（Ficz）喂养HFD小鼠。Ficz治疗不会影响体重增加，但它可改善了葡萄糖代谢。如图3 A所示，通过稳态模型评估- 胰岛素抵抗法（HOMA-IR）可观察到HFD组中的胰岛素抵抗指数显著下降。Ficz喂养的HFD小鼠在OGTT期间也表现出更好的葡萄糖清除率，并且ITT期间具有更高的胰岛素敏感性（图3B-E）。并且在Ficz处理的小鼠中观察到较低的肝脏甘油三酯含量，血清中谷丙氨酸转氨酶和胆固醇也较低，表明Ficz处理可显著改善脂肪肝的特征（图3F-J）。Ficz处理不能改善肠道菌群产生的AhR激动剂受损的症状或者改变肠道菌群的组成（图3K-L），但Ficz处理可以恢复AhR靶基因Cyp1a1和IL-22的表达。 图3 AhR激动剂治疗减轻饮食诱导的代谢紊乱 A：CD和HFD喂养的小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的空腹稳态模型评估胰岛素抵抗测定 B：CD和HFD喂养的小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的口服葡萄糖耐受试验前和后的血糖水平（OGTT，和HFD进行比较，n=12/组）C：OGGT的AUC D：ITT前和后的血糖水平（和HFD进行比较，n=6-10/组） E：ITT的AUC F：CD和HFD喂养的小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的肝组织切片中脂质的面积，以面积的百分比（AOI）进行计算 G：CD和HFD喂养的小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的肝组织HE染色结果 H：禁食6h后肝脏甘油三酯的含量 I和J：CD和HFD喂养的小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后血清中ALT（I）和总胆固醇（J）浓度 K：CD和HFD喂养的小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后粪便的AhR活性 L：CD和HFD喂养的小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后粪便肠道菌群的主成分分析 所有的数据用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验，采用ANOVAs或Bonferroni 或Dunn’s post hoc tests的Kruskal-Wallis检验进行统计学分析(*p < 0.05,**p < 0.01, ***p < 0.001)。数据用means ± SEM表示。 4、AhR激动剂治疗可减轻遗传导致的代谢综合征症状 为了进一步探索Ficz对于肠道菌群的影响，作者采用了瘦素敲除小鼠模型，即ob/ob小鼠，是一种因为过度进食而发展出代谢综合征的动物模型。与HFD小鼠相似，给予Ficz后，ob/ob小鼠的6h空腹血糖显著低于对照组（图4A），并且其葡萄糖和胰岛素代谢障碍也得到显著改善（图4B-E）。对Ficz处理后的小鼠进行进一步的探索，发现Ficz处理后的小鼠肝脏中脂质含量及油三酯含量和血清中ALT和甘油三酯的含量显著下降（图4F-J）。综上的所有结果均表明AhR激动剂Ficz在HFD诱导和遗传导致的代谢综合征中都具有治疗作用。 图4 AhR激动剂治疗减轻遗传所导致的代谢紊乱 A：ob/ob及野生型（WT）小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的禁食6h的血糖水平 B：ob/ob及WT小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的口服葡萄糖耐受试验前和后的血糖水平（n=14-15/组） C：OGGT的AUC D：ITT前和后的血糖水平（n=7-8/组） E：ITT的AUC F：ob/ob及WT小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的肝组织切片中脂质的面积，以AOI进行计算 G：ob/ob及WT小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后的肝组织HE染色结果 H：禁食6h后肝脏甘油三酯的含量 I和J：ob/ob及WT小鼠用Ficz治疗或DMSO处理后血清中ALT（I）和总甘油三酯（J）浓度 所有的数据用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验，采用ANOVAs或Bonferroni 或Dunn’s post hoc tests的Kruskal-Wallis检验进行统计学分析(*p < 0.05,**p < 0.01, ***p < 0.001)。数据用means ± SEM表示。 5、补充可产生丰富AhR配体的罗伊氏乳杆菌可改善代谢综合征 通过给予可产生丰富AhR配体的罗伊氏乳杆菌（L. reuteri），作者进一步研究AhR在代谢综合征中的作用。给予L. reuteri后可以恢复HFD所导致的受损的肠道菌群产生的AhR活性（图5A）。相比较于MRS组，HFD补充L. reuteri后可显著改善胰岛素抵抗指数，葡萄糖清除率以及更好的胰岛素敏感性（图5B-F）；并且与给予Ficz相似，给予L. reuteri后可显著改善肝功能指标，包括肝脏甘油三酯含量，血清甘油三酯含量以及谷丙转氨酶含量。当在HFD喂养的的AhR-/-小鼠中给予L. reuteri，L. reuteri在口服葡萄糖糖耐量实验和肝脏脂肪变性期间对葡萄糖清除没有表现出改善的效果，表明该菌株发挥作用的机制之一需要依靠AhR。最后，另一种不产生AhR配体的罗伊氏乳杆菌在OGTT和脂肪变性（期间对葡萄糖清除也没有任何有益作用。总的来说，图5的结果表明肠道菌群特异性激活AhR有助于维持代谢稳态。 图5 补充产生丰富AhR配体的菌株可减轻饮食诱导的代谢紊乱 A：CD和HFD喂养的小鼠用L. reuteri或空白培养基处理后粪便AhR激动剂活性的定量 B：CD和HFD喂养的小鼠用L. reuteri或空白培养基处理后空腹稳态模型评估胰岛素抵抗测定 C: CD和HFD喂养的小鼠用L. reuteri或空白培养基处理后的口服葡萄糖耐受试验前和后的血糖水平（n=8/组） D：OGGT的AUC E：ITT前和后的血糖水平（n=7-8/组） F：ITT的AUC G：CD和HFD喂养的小鼠用L. reuteri或空白培养基处理后的肝组织切片中脂质的面积 H：CD和HFD喂养的小鼠用L. reuteri或空白培养基处理后的肝组织HE染色结果 I和J：CD和HFD喂养的小鼠用L. reuteri或空白培养基处理后血清中ALT（I）和总胆固醇（J）浓度 所有的数据用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验，采用ANOVAs或Bonferroni 或Dunn’s post hoc tests的Kruskal-Wallis检验进行统计学分析(*p < 0.05,**p < 0.01, ***p < 0.001)。数据用means ± SEM表示。 6、AhR活性的恢复可改善代谢综合征动物模型中的肠屏障功能 肠道屏障功能障碍以及低度的炎症反应被认为是代谢紊乱的显著特征，采用USSing chamber系统评估不同肠段的渗透性来确定AhR的激活是否影响肠屏障功能。HFD喂养的小鼠中荧光素标记的脂多糖（F-LPS）、荧光素标记的磺酸（FS4）以及安东尼亚红标记的葡聚糖（ARD4）的迁移量更高（图6A），特别是在结肠和空肠中。Ficz治疗有效减轻HFD喂养小鼠的屏障功能障碍（图6A）。 为了确认Ficz信号传导是否特异性的改善肠道屏障功能障碍，研究人员采用人肠上皮细胞的还原系统。Ficz处理可阻止TNF-α诱导的反式上皮细胞电阻（TEER）降低和荧光素酶标记的葡聚糖（FD4）转运的增加（图6B-C）。研究人员通过测量血清中可溶性CD14(sCD14)的浓度来确定HFD喂养的小鼠中增加的通透性的相关性。sCD14是LPS活化后从单核细胞中释放出来的物质，测定其浓度可用作系统性LPS可用性的替代指标。与CD喂养的小鼠相比，HFD喂养的小鼠具有更高的sCD14，但是给予Ficz后可显著阻止血清中sCD14的增加（图6D）。除此之外，研究人员还发现Ficz处理后，脾细胞释放的炎症因子TNF-α和IFN-γ水平显著降低（图6E-F）。因此，AhR激动剂有助于代谢综合征肠道屏障障碍的修复。 图6 AhR激动剂可改善HFD诱导的肠屏障功能障碍和恢复受损的肠内分泌 A：在USSing chamber中不同肠组织中LPS的迁移 B：在Ficz或DMSO存在的情况下用TNF-α或空白溶剂处理后的Caco-2细胞的TEER C: 体外单层肠上皮细胞的FD4的迁移 D：CD和HFD喂养的小鼠在Ficz存在与否的情况下血浆中sCD14的浓度 E和F：用丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）或离子霉素刺激脾细胞后产生的TNF-α（E）和IFN-γ的含量 所有的数据用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验，采用ANOVAs或Bonferroni 或Dunn’s post hoc tests的Kruskal-Wallis检验进行统计学分析(*p < 0.05,**p < 0.01, ***p < 0.001)。数据用means ± SEM表示。 7、AhR配体诱导肠促胰岛素激素（GLP-1）的分泌 AhR激动剂除了对肠道屏障有影响外，可能在肠道还具有其他的靶标来改善代谢综合征的症状。肠道菌群产生的吲哚可以有效刺激肠内分泌细胞（EECs）分泌GLP-1，但这种刺激与AhR的潜在联系并未有人研究。作者在HFD喂养的小鼠中发现其血浆中编码GLP-1的肠胰高血糖素（Gcg）mRNA水平比起CD喂养的小鼠显著降低，且其血浆中的GLP-1也是呈下降的趋势。而Ficz处理可显著恢复HFD喂养小鼠中Gcg的mRNA表达下降和血浆中GLP-1的减少（图7A-B）。 为了研究AhR激动剂是否直接刺激GLP-1的产生，作者采用Ficz刺激同时表达Gcg基因和AhR的小鼠肠内分泌细胞GLUTag细胞系。结果表明相比较于通过G蛋白偶联受体起作用的GLP-1分泌的强诱导物毛喉素（Forskolin），Ficz可大幅度提高GLP-1的分泌水平，并且这种增长可被AhR的拮抗剂所抑制，表明Ficz提高GLP-1分泌是AhR特异性的（图7C）。因此肠道菌群可依赖于AhR信号传导调节GLP-1来改善代谢紊乱。 图7 AhR激动剂可促进肠分泌GLP-1 A：CD和HFD喂养的小鼠在Ficz存在与否的情况下不同肠段中Gcg的mRNA表达 B：CD和HFD喂养的小鼠在Ficz存在与否的情况下血清总GLP-1的浓度 C: 在AhR拮抗剂存在与否的情况下Ficz和毛喉素慈济GLUTag细胞分泌的GLP-1的含量测定 所有的数据用Kolmogorov-Smirnov检验进行正态性检验，采用ANOVAs或Bonferroni 或Dunn’s post hoc tests的Kruskal-Wallis检验进行统计学分析(*p < 0.05,**p < 0.01, ***p < 0.001)。数据用means ± SEM表示。 结 论 如下图所示，本研究确定了一种将肠道菌群与代谢综合征联系起来的新机制：肠道菌群产生的AhR配体能力的降低导致肠道通透性增加，LPS迁移量升高，肠道炎症反应加重，IL-22信号下降，GLP-1的分泌减少，最终促进更严重的代谢综合征，加重葡萄糖代谢紊乱和肝脏的脂肪变性。 图8 摘要图 评 论 本文在代谢综合征患者的临床表现上发现AhR与肠道菌群之间的联系，并通过两种动物模型以及相应的细胞实验来证明肠道菌群产生的AhR配体可减轻代谢综合征，恢复肠道AhR信号通路有益于代谢综合征，提高GLP-1的分泌从而减轻葡萄糖代谢紊乱。本文将临床与基础研究联系起来，从表象到机制研究，深入阐明AhR与肠道菌群在代谢综合征中的作用。 |
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