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单克隆抗体下游纯化中采用的捕获工艺不仅是通过优化哺乳动物细胞表达系统使产生的抗体滴度增加而受到最严重影响的过程，而且也是决定整体产量、产品质量和经济成本的最重要的纯化步骤。从复杂原料中提取抗体的分离技术的进步，是近10年来下游纯化工艺创新的重点之一。本文评估了在抗体捕获工艺中使用的新一代层析介质，包括Protein A、阳离子交换和混合模式层析，以了解每种层析方法带来的好处并解决其独特的挑战。结果表明，在使用新一代载量超过100mg/ml的阳离子交换介质时，发现新一代 Protein A介质其载量的提高有助于解决高浓度造成的聚体问题，且多模式阳离子交换介质在用于捕获工艺设计时也凸显出不错的潜力。捕获层析技术的新前景使得实现产品质量好、工艺效率高的整体下游纯化结果成为可能。 单克隆抗体是一类非常成功的治疗分子，用于治疗各种疾病。然而，除了缺乏合适的目标和长期开发时间，克服高昂的制造成本是开发单克隆抗体药物中的主要挑战。历史上，由于哺乳动物细胞培养系统很难达到克每升的水平，所以单克隆抗体(mAb)药物的发展着重于上游表达水平的提高。在生产一种抗体药物的总成本中，下游纯化(DSP)占60%以上，其中捕获步骤是决定整个工艺有效性和效率的关键步骤。因此，捕获技术的进步对制造工艺成本有着重要的影响。此外，捕获技术的选择往往决定了后续的精纯策略，这需要设计并适应捕获工艺，以达到所需的工艺效率和最终药物产品的纯度要求。 意识到捕获步骤在下游纯化中的关键作用，特别是在有效处理高生产力哺乳动物细胞培养液的情况下，分离技术和生物技术行业的开发者在过去十年里一起合作创新和改进，以推动下游抗体纯化中捕获步骤的进步。为开发出针对Dyax公司噬菌体展示技术平台的mAb产品候选物的高效和有效的下游纯化工艺，我们探索了新一代层析技术并为每种类型的层析分离开发出了不同的操作策略，以使现代捕获纯化技术最大利益化。我们的研究重点是基于载量和运行速度的层析捕获工艺的效率，以及基于分离分辨率和上样、清洗、洗脱和清洁策略的过程有效性。为解决高滴度的哺乳动物细胞培养生物反应器批量处理的难题，也提出了若干方法。 2.1材料 研究中使用的人类单克隆抗体(hMabs)来自Dyax抗体噬菌体展示库。hMab产品由中国仓鼠卵巢细胞系表达。通过深度过滤使补料分批CHO发酵培养液澄清，随后通过下文所确定的工艺对其进行了下游净化。 捕获步骤中Protein A介质包括：GE Healthcare公司(Piscataway, NJ, USA)的Mabselect，Mabselect SuRe，Mabselect Extra和Mabselect SuRe LX；Millipore 公司(Bedford, MA, USA)的ProSep Ultra Plus；Applied BioSystems公司(Bedford. MA, USA)的MabCapture A以及Tosoh Biosciences 公司(Philadelphia, PA, USA)的Toyopearl AF-rProtein A-HC 650F。用于阳离子交换介质研究的是Thermo Fisher的POROS HS 50和POROS XS，GE Healthcare的CaptoS，Tosoh Biosciences的Toyopearl SP-650M和Gigcap S-650M，Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA, USA)的UNO S和Nuvia S，EMD Chemicals Inc. (Gibbstown, NJ, USA)的Fractogel SO3和Eshmuno S。Pall Life Sciences (East Hills, NY, USA)的混合模式介质MEP (Mercapto-EthylPyridine) HyperCel，GE Healthcare的Capto MMC，Bio-Rad的Nuvia cPrime 以及Tosoh Bioscience的Toyopearl MX-Trp-650M均进行了研究。此外，来自Natrix (Burlington, Canada)的阳离子交换膜也包括在载量研究中。 所有化学试剂来自Sigma（St.Louis，MO，USA）和J.T. Baker (MallinkrodtBaker, Phillipsburg NJ USA)。使用Waters (Millford, MA, USA)的AP柱和GE Healthcare的XK柱在GE Healthcare 的AKTA LC系统进行层析分离操作。 2.2动态载量研究 动态载量研究是在常温下用Waters公司的AP微型柱（5×100mm）进行的，每种介质的填充床高度约为10cm。采用预先确定的理论塔板高度(HETP)和峰值不对称因子(As)来确保柱填充效率。在测定载量之前，建立了特别的缓冲条件，并证明其适用于每种层析模式。当hMab上样到柱上时，收集流穿样品并通过Protein A-HPLC分析hMab含量。通过（C/C0）x 100计算出柱穿透百分比（其中C0和C分别表示hMab上柱和流穿的浓度）。 2.3层析纯化研究 在选定的柱条件下，所有的层析工艺研究从实验室规模(water AP柱)到中间规模(XK 柱)，再到中试规模(BPG柱)都使用预先规定的停留时间。柱的填料高度为10-20cm，通过测定HETP和As值来保证填料效率。每个柱子都在特定柱的载量范围内上样，该范围在限定结合条件下由动态载量研究确定。模拟移动床(SMB)研究是在确定的清洗和洗脱过程前，将Mabselect Protein A柱上样到其饱和载量。用分析Protein A-HPLC和A280测定工艺收率。采用聚体指数、SEC-HPLC和杂质特异性ELISAs法对产品纯度进行评价。 2.4 hMab浓度测定 CHO培养上清液中hMab浓度用前文所述的分析ProA-HPLC测定(Chen et al.，2008)。用Beckman Coulter(Fullerton, CA, USA)公司的DU-800分光光度计在280 nm处测定纯化样品中的hMab浓度。 2.5 产品纯度评估 使用前文述及的Molecular Devices (Sunnyvale, CA, USA)公司的Spectramax Plus384分光光度计测量280nm (OD280)和350nm (OD350)的光学密度，对不溶性聚体水平进行评估。根据下式[7]计算不溶性聚体指数(AI)：
用SEC-HPLC测定可溶性聚体的含量，使用的柱子来自Tosoh Biosciences (Philadelphia, PA)公司的7.8 x 300 mm SWXL3000，流动相为200mM磷酸缓冲液，0.15M氯化钠，pH 7.0，并使用带有Waters公司Waters 2996 PDA检测器的2695 Alliance HPLC系统进行含量测定。 Protein A ELISA使用的是来自Repligen (Waltham, MA, USA)的rProtein ATM ELISA试剂盒，CHO宿主细胞蛋白 (HCP) ELISA试剂盒采用Cygnus Technologies公司的CHO HCP ELISA试剂盒F550第3代。这两种ELISA均按照厂家说明进行操作。 3.1 Protein A亲和层析 Protein A亲和层析在抗体纯化的发展过程中一直是占主导地位的捕获方法。在生理条件下，Protein A与IgG结合的高特异性使得这一步亲和层析可以去除大部分来自哺乳动物细胞上游过程的杂质。然而，传统Protein A介质的动态载量通常是有限的，其最大值为35-40 mg/mL。此外，载量不仅对停留时间非常敏感，而且还会因为特定mAb的结构理化性质发生显著变化。为解决较高的介质成本和相对较低的载量问题，生产厂家现在已经广泛采用“每批次多次循环”的方式处理高滴度细胞培养液。然而，这种放大设计显著增加了收获保持和捕获过程时间、缓冲液消耗和洗脱产品的体积，这限制了这种方法在特定细胞培养批次中处理大量产品的实现。 Dyax hmAb生产过程中，fed-batch生物反应器的平均滴度为3-4 g/L。Dyax hmAb产品在传统Mabselect Protein A上的载量范围是15-40 mg/mL。对于hmAb产品DX-M14，当使用传统Mabselect或Mabselect SuRe介质时，Protein A的载量约为18mg / mL（在10％流穿时载量的80％），这导致在使用45-60cm直径大小的柱子时，每批次需要10-17个循环（表4）。当我们开发的工艺扩大到2000L GMP生产时，高循环次数的Protein A捕获工艺要么增加了柱尺寸和介质成本，要么显著增加了处理时间，对产品质量产生了负面影响。为了寻找更有效、更高效的捕获工艺，我们对市场上的新一代Protein A介质和选择性捕获层析技术进行了研究。在对Protein A介质、Applied Biosystems公司的聚苯乙烯-二乙烯苯Poros MabCapture A、Millipore孔径可控的多孔玻璃基片ProSep A Ultra Plus、琼脂糖高交联的天然聚合物MabselectSuRe Protein A介质的研究中，琼脂糖基质的Protein A其载量对停留时间明显更敏感。基于合成聚合物的MabCapture A可以在1分钟的停留时间内进行操作，且载量无明显的下降。与传统300-500 cm/h的工艺速度相比，这样的改进意味着时间减少了3-5倍。但是，在合并多循环方法时，仅仅增加工艺速度而不提高载量是无效的，因为它不能解决载量的挑战。因此，我们评估了新一代Protein A介质的载量。Millipore的ProSep A Ultra Plus Protein A通过对介质孔径进行优化，以获得更大的表面积用于Protein A配体固定。GE Healthcare的MabselectXtra和MabselectSuRe LX通过增加孔隙率、减小颗粒尺寸和优化配基偶联提供了更高的动态载量。采用工程设计的C域和多点连接进行配体偶联，提高了Toyopearl AF-rProA HC-650F的容量。新一代的ProA介质在动态载量上有显著的提高，尤其是MabselectSuRe LX和Toyopearl AF-rProA HC-650F，与传统的Mabeselect和MabselectSuRe Protein A相比，它可以提供平均两倍或更高的载量。Toyopearl高容量Protein A介质是一种非常有吸引力的选择，它可以显著提高载量，而不需要过长的停留留时间(表1)。通过使用相同的柱硬件，可以显著减少Protein A柱子捕获hmAb DX-M14的循环数。同时，还研究了层析操作技术对工艺效率的提高。传统的层析方法在0%的流穿时运行，但由于珠粒的大量运输限制，使总载量的使用率仅达到50%左右。模拟移动床（SMB）技术将层析分离的单柱操作改变为一系列小柱子进行连续处理的方式。SMB工艺开发和硬件的发展近年来包括PALL公司的Cadence BioSMB平台和AKTA PCC,使得SMB技术的实施从实验室规模扩展到当今生物制药行业的生产工厂，使提高工艺效率成为可能,特别是对于昂贵的Protein A捕获层析步骤[15]。在模拟移动床(SMB)操作下，我们评估了Protein A亲和分离对产品质量的影响。在清洗和洗脱工艺条件之前，用mAb-P澄清收获液将Mabselect Protein A柱上样到其预先确定的最大载量(5%流穿时所确定的动态载量的80%)或饱和容量。实验结果表明，单个Mabselect Protein A柱在SMB模式下可达到约两倍的批处理能力，而对产品质量无任何负面影响。事实上，模拟SME模式获得的蛋白洗脱池中的宿主细胞蛋白水平甚至可能比传统的单柱模式低，这是因为宿主细胞蛋白具有较少的结合可用性，因此有机会与mAb产物共纯化。因此，即使用传统的Mabselect Protein A介质，SMB操作也可以提高Protein A亲和捕获工艺的吞吐量和生产率，从而获得同等或更好的产品质量。 除了提高工艺效率外，应该努力提高Protein A亲和捕获工艺的纯化分辨率和产品质量。Protein A亲和分离在中等电导和中性pH的生理条件下进行，使单克隆抗体与层析介质上的Protein A配体结合，后利用酸性pH破坏Protein A-IgG结合作用，从而洗脱抗体产物。清除宿主细胞相关杂质已开发出了许多的清洗条件。高盐浓度的洗液通常被加入以破坏非特异性结合的杂质。一些洗涤剂和氨基酸缓冲液可以用来清除宿主细胞蛋白、DNA、内毒素和病毒。需要强调的是在洗脱前加入低pH洗液的好处。低pH洗液是由与洗脱缓冲液具有相同缓冲成分的溶液组成，但其pH值最低，而mAb产品不必被洗脱下来。因此低pH值清洗步骤不仅可以去除如抗体片段这种松散杂质，而且能增加洗脱过程中pH下降的斜率，使洗脱pH得到优化，洗脱pH稍高，洗脱体积变小，这对于产品质量和后续柱上样过程可能是有益的(图1)。 众所周知，洗脱缓冲液是获得理想产品纯度和收率的关键。Protein A工艺的低pH洗脱条件为病毒失活提供了有效步骤，但也可能对抗体的三级结构产生不利影响，使得IgG聚集。在某些情况下，洗脱缓冲液pH的细微差别会导致产品洗脱池的总体水平发生显著变化(图2A)。尽管Protein A不是传统上公认或声称的去除产品中聚体的纯化功能，但我们发现，在澄清的CHO细胞培养基中存在高浓度的聚体时，终产品的质量可能依赖于净化过程中所有层析步骤的综合降低聚体的能力。在我们的例子中，DX-M14，VH3家族衍生的全人单克隆抗体，在澄清收获液中发现了大约18%的聚体，但在通过下游纯化过程清除聚体后，DX-M14 mAb分子的药物和药物产品具有正常的稳定性。由于稳健的洗脱模式、对碱性净化条件较强的抵抗力以及较低的配体浸出等优点，Mabselect SuRe最初被选为Protein A介质。然而，在洗脱pH优化过程中，发现由于mAb分子可变区域的结合位点减少，导致从Mabselect SuRe介质解吸附下来的抗体分子表现出一种全有或全无的方式，从而降低了分离抗体分子聚体的能力。相反，结合在Mabselect Protein A 上的DX-M14分子的聚体形式比单体形式稍强，这样就能够通过洗脱pH优化和峰切割操作除去。DX-M14通过Mabselect Protein A处理后，其聚体减少25%-30%，这使高分子量聚合（HMW）的百分比从澄清培养液的18%下降到Protein A洗脱产品池的12%-13%（图2B），这对单体获得具有99%以上的高纯度药物至关重要。 最后，我们还研究了不同Protein A介质和用于从Protein A柱子洗脱抗体的化学缓冲系统对产品质量的影响。柠檬酸盐和醋酸盐是最常用的缓冲系统。醋酸盐缓冲液通常被选择用于随后的阴离子交换层析纯化步骤。其他的氨基酸缓冲系统，如甘氨酸和精氨酸，用来测试它们减少IgG产物聚体的能力。在预先确定的最佳pH（pH 3.2）下我们比较了四个缓冲系统，从相同的Mabselect Protein A柱中洗脱Dyax hMab DX-T1以尽量隔离特定缓冲液对产品质量的影响。在可能的条件下，通过调整氯化钠(NaCl)浓度，使电导率保持相对恒定。图3显示了Protein A层析分离的洗脱路径，以及洗脱pH的斜率变化，这是洗脱过程中的监测情况。每个洗脱缓冲系统都能从Protein A柱子上解吸附下不同洗脱效率的抗体，这反映在洗脱峰的pH梯度、产品池体积和纯度上。洗脱后，将抗体产品池在室温下保持低pH 1小时，进行病毒失活，然后用1 M Tris碱基缓冲液中和，为后续的阴离子交换柱上样做好准备。在pH值为8时阴离子交换柱进行上样，从洗脱pH到最终pH值的整个中和过程收集样品。表2显示了不同洗脱缓冲液对应的洗脱池浊度、体积、产量和杂质水平的总结，这些洗脱缓冲液来自于同一个hmAb (DX-T1) Protein A捕获过程。0.1 M甘氨酸体系的浊度最高，产率最低，浸出ProA水平最低，这说明与浸出ProA-IgG复合物有关的沉淀已通过过滤去除。相反，精氨酸体系通过SEC-HPLC得到了相对纯的产物，但含有最多的浸出Protein A，这支持了精氨酸在低pH条件下通过阻止聚体形成而稳定mAb产物的观点。醋酸盐缓冲液是一种相对较弱的缓冲液，一旦抗体分子被洗脱，就会导致产品池的pH值高于病毒失活阈值，这就需要对病毒失活进行额外的pH值滴定步骤。然而，在我们的案例中传统的柠檬酸缓冲体系产生了在聚体、浸出Protein A和宿主细胞蛋白(HCP)方面可接受的产品。最后，我们的研究揭示了不同的Protein A介质对CHO宿主细胞蛋白的清除表现出不同的能力，也可能导致Protein A浸出量的不同。图4展示了我们的数据，显示了洗脱产物池中浸出Protein A和CHO HCP水平的差异，这些洗脱产物使用相同的单克隆抗体原料，以及相同的工艺条件经过不同的Protein A介质处理得到 (相同上样量、清洗和洗脱缓冲液)。 总之,尽管有许多商用Protein A介质实现抗体捕获功能,但我们的研究表明,不同的Protein A介质不仅表现出截然不同的载量和工艺速度效率,而且可以对工艺操作和产品质量产生重大影响，包括聚体水平、Protein A配体浸出以及CHO宿主细胞杂质，进而反过来影响中和产品池的浊度水平。Protein A亲和层析工艺的创新使这种古老而强大的亲和层析技术仍然是mAb产品从实验室规模到商业规模的主要捕获分离方法。 3.2 CEX介质发展 离子交换层析(IEX)是生物制药下游工艺中最流行、最强大的层析分离技术之一。除了单克隆抗体产品外，阳离子交换层析(CEX)已被广泛应用于重组蛋白制造工艺的捕获。此外，阳离子交换层析作为一种有效的中间精细纯化步骤，在工业平台下游的单克隆抗体纯化工艺中发挥着重要作用。近年来，离子交换介质设计和工艺中最显著的成就是结合IgG抗体的动态载量显著提高，超过100mg/ml介质。CEX膜技术也具有可接受的动态载量，在高工艺效率和低缓冲消耗方面具有显著的效益。因此，阳离子交换分离成为处理高滴度哺乳动物细胞培养上清液的一种潜在有效的捕获方法，并在降低生产成本的同时促进生产规模的扩大。为了成为一种适合于捕获工艺的替代层析方法，现代CEX层析介质需要克服两个挑战。一个是与澄清细胞培养收获液的上样条件的相容性问题，因为CEX的载量随着上样样品pH和电导率的增加而下降，因此在捕获上样条件下，CEX介质的高载量益处迅速减小。一些大规模的生产工艺采用切向流过滤(TFF)，在CEX捕获前将收获液和原料结合起来调节。TFF方法有许多缺点，包括剪切诱导的细胞裂解和较差的回收率，这使得它难以成为哺乳动物细胞培养的主流收获工艺。因此，在考虑CEX层析作为捕获工艺时，考虑如何解决上样条件的挑战是很重要的。另一个挑战是相比Protein A层析在解决宿主产生的杂质时能力低下。在选择阳离子交换层析作为捕获步骤时，需要仔细设计下游精细纯化步骤，以确保最终释放的药物物质满足规范，特别是对宿主细胞蛋白质杂质。本节研究的主要内容是：1）研究现代阳离子交换介质的性能、评估其潜在的适用性，以最少的操作从澄清的补料分批培养细胞收获液中捕获mAb产品；2）开发阳离子交换层析分离策略，以提高宿主细胞蛋白杂质的清除率。 利用Dyax hmAb DX-K1测试不同的商用阳离子交换介质的载量，首次评估了阳离子交换层析在捕获工艺中应用的潜力。图5A显示了从传统阳离子交换介质到新一代阳离子交换介质其载量的提高。筛选出100mg/ml或更高载量要求的新一代CEX介质，以评价在工作pH和稀释范围内来自补料分批培养的CHO细胞的单克隆抗体的动态载量。号称拥有超过100 mg/mL载量的商用阳离子交换介质在不同上样条件的挑战下，将调整为不同pH和电导率的Dyax hmAb DX-K1的Protein A纯化产物作为样品，检测其载量。图5B显示，尽管SO3的配位化学相同，但不同的配体密度、配体耦合策略、介质基体化学、颗粒大小、孔隙大小和形态，使得mAb产品在不同上样条件的挑战下其载量产生了显著差异。与其他阳离子交换介质相比，Poros 50 XS能更好地耐受上样pH和电导挑战，因此被选择在捕获工艺开发中进行进一步的探索。 为了利用现代CEX介质在捕获工艺中的高载量效益，哺乳动物细胞培养液通常需要通过降低pH和电导率来调节。然而，通过调节pH和稀释方法来调节收获液，往往会导致产品沉淀。对阳离子交换捕获工艺的潜在上样样品调节pH和稀释，继而检测其混浊现象和相关的mAb产品损失。图6通过两个Dyax hmAbs (DX-M14和DX-P)示例说明了使用澄清的CHO批处理细胞培养收获液的上样调节行为。随着pH和电导率的降低，mAb产品可能在收获液中沉淀。pH值和电导率的沉淀阈值因不同的mAb产品而异。表3展示了与其他分离技术相比，用Poros 50 XS从CHO从分批培养的细胞培养液中捕获3.5g/L滴度的Dyax hmAb DX-K1的阳离子交换载量优势，表明新一代阳离子交换介质是一种很有吸引力的替代捕获工艺。 尽管具有高载量的好处，但使用高载量介质的一个潜在问题是产品在解吸附过程中的浓度激增而导致聚体形成。我们设计了一项综合研究，研究了Dyax hmAb DX-K1下游工艺开发过程中抗体产物洗脱动力学(图7A-C)。收集了从低、中、高载量CEX介质在洗脱峰上的样本，以评估产品浓度和聚体水平。监测洗脱过程中340 nm处的吸收值，间接表明蛋白通过洗脱峰的压力(图7A)。CEX介质的载量越高，洗脱过程中产物浓度峰值越高。当载量超过100mg/ml时，在解吸峰处最大IgG浓度可超过140mg/ml（图7B）。SEC-HPLC分析表明可溶性聚体分布在洗脱峰处有两个高聚集区呈“U”形分布：洗脱过程的前部和尾部（图7C）。洗脱峰前的聚体水平与产品浓度的激增相关。有趣的是，我们发现在洗脱峰前的聚体对产品池的最终聚体水平的影响并不比在尾端洗脱的大。这些聚体似乎是由于产品浓度暂时增加而形成的，当如此高的浓度在最终的产品池中被稀释时，是可逆的。相反，出现在洗脱峰尾部的聚体，最可能是由结构变化形成的不可逆聚体，它们存在于原始样品中，并通过CEX分离在峰尾富集。所研究的每一种CEX介质在洗脱峰尾端减少聚体洗脱的能力不同(图7C)。Poros 50 HS具有中等的载量和最小的珠粒尺寸，表现出最高的分辨能力，生产出的DXK1产品纯度最高。因此，对于需要高分离分辨率的中间精细纯化，高载量的CEX介质可能不是最好的选择。相反，具有中等载量和较小珠粒尺寸的CEX介质更受青睐。 为了提高阳离子交换捕获工艺对宿主细胞蛋白清除能力，提出了两种分离策略，一种是高pI (pI > 8.5)mAb产品的伪pI亲和方法，另一种对能耐受强阳离子交换的mAb产品采用纯电导洗脱方法。第一个伪pI亲和法需要对澄清的CHO进料批次细胞培养物进行最小pH调节，并允许mAb产品在最高pH值下与阳离子交换介质结合，通常在pH 5.5或6时亦保持合理的载量。CEX介质的上样量主要是通过稀释来维持的。如图8A所示，pI=8.5的DX hmAb DX-M12被Poros 50 XS柱在pH 5.8～6、电导约5mS/cm时捕获，这些条件可通过在线稀释来实现。在这样的上样条件下，Poros 50 XS对hMab DX-M12的动态载量仍能保持在60mg/ml介质。由于DX-M12在上述高pH条件下与CEX柱较弱地结合，因此在上样后仅轻微改变缓冲液的pH值和电导率（pH 7和电导率8-9MS/cm）可被立即洗脱。因此，CEX分离是通过需要纯化的抗体产物的结合和洗脱之间的微小的pH和电导率差异来实现的。pI等于或低于结合pH值的宿主细胞杂质将不能与柱结合，从而流穿而除去，而具有高于洗脱pH条件的pI的污染物将保持在柱上，直到在清洁步骤中清除。使用CEX捕获纯化方法对CHO宿主细胞蛋白的清除率约为95%，从起始样品的40505 ppm下降到CEX捕获产品池的2000ppm。第二种纯电导率洗脱法分离电导率分离因子，并可应用于能耐受强阳离子交换的mAb产品，这要求在解吸附附的洗脱缓冲液中需要超过0.5M的氯化钠。在图8B中描述的情况下，在pH 5.0、电导率约12MS/cm时，操作CEX捕获工艺来结合澄清CHO细胞培养上清液中的hMAb产物-DX-P。然后通过增加盐浓度，同时保持pH值与上样条件一致，对结合在CEX柱上的抗体产物进行洗脱。在设计CHO宿主细胞蛋白清除的洗脱策略时，在分离过程中单独分离电导率元素而不涉及pH值是至关重要的。与增加pH相比，增加盐浓度对CHO HCP的降低水平可高达8倍(CHO HCP分别降低93%与37%)。最后，我们的研究表明：与传统的Protein A层析捕获工艺相比，CEX捕获同样提供了在洗脱产物池中生成较低聚体水平的优势(表6)。在某些情况下，聚体水平的差异可能是非常显著的[25]。另一方面，CEX捕获工艺在去除抗体轻链片段和宿主细胞源性杂质方面的分辨能力较Protein A亲和层析方法低。通常，CHO宿主细胞蛋白水平与Protein A捕获步骤产物池不匹配，直到随后的阴离子交换层析步骤通过纯化步骤流穿掉（表6）。 总的来说，与传统的Protein A亲和层析相比，具有高载量介质的CEX层析可在调节原料pH和/或稀释操作下提高工艺效率2-3倍。然而，当直接上样澄清细胞培养液时，与载量提高的新一代Protein A相比，其载量优势降低。因此，尽管阳离子交换与Protein A层析分离方法在捕获工艺中的差距逐渐缩小，但阳离子交换层析并没有达到取代Protein A亲和层析的程度。我们发现，在两种情况下，CEX色谱可以显示出与亲和Protein A层析捕获同等的益处：一种是当特定的单克隆抗体产品的Protein A载量低于30 mg/mL时，CEX层析法相对于Protein A层析法对工艺效率有显著提高(表4)；另一种是当在Protein A纯化条件下处理的mAb产品存在明显的聚体问题时，阳离子交换捕获可为下游纯化工艺设计中控制产品质量提供解决方案。 3.3 混合模式介质发展 混合模式层析法是分离技术用于抗体捕获工艺的另一种选择。其中，巯基乙基吡啶（MEP）是用一种伪亲和配体设计的能够在生理条件下通过疏水性相互作用与抗体产物结合的方法，在pH值超过4.0时通过静电斥力来洗脱，这些特点使它成为从澄清细胞培养液中获取抗体产品的绝佳候选方法。我们的研究评估了以前报导过的MEP混合模式层析法用于捕获单克隆抗体。然而，尽管MEP配体设计取得了进展，但疏水交互结合机制产生了与传统疏水交互层析（HIC）相似的低载量。较低的载量和分离分辨率、以及一些介质性能问题（例如，填充床的稳定性、清洗过程介质变色），限制了MEP混合模式层析法在工业规模的单克隆抗体制造中成为一种有效的替代Protein A分离的方法。 近年来，几种新型多模式阳离子交换介质已在市场上推出。与传统的CEX介质相比，配体被设计为能耐受更高的盐浓度和pH值，并通过额外的分离选择性方式提供不同的分辨率[29][30]。我们对三种多模式阳离子交换介质进行了评价：分别是GE Healthcare的CaptoMMC、Bio-Rad的Nuvia cPrime、Tosoh Bioscience的Toyopearl MX-Trp-650M，研究它们作为捕获介质候选者的性能。对高pH值和电导率上样挑战的研究表明，当进样的pH值和/或电导率增加时，多模式阳离子交换介质与传统的阳离子交换介质表现出相似的载量下降的情况。然而，与传统的CEX介质相比，多模式阳离子交换介质对上样条件的挑战有了更好的耐受力（图9A）。图9B显示了Dyax hmAb DX-P在三种多模式阳离子交换介质柱子的动态载量。在pH值为5.5和电导率为12 mS/cm的上样条件下，所有三种混合模式CEX介质均获得50mg IgG/ml介质的载量，这与新一代Protein A亲和介质可以达到的非常相似。 根据文献和我们的经验，虽然IgG1产物具有结构相似性且Protein A配体与IgG Fc恒定区具有独特的结合位点，但在不同IgG分子存在时Protein A柱的载量（范围为10～40 mg/ml）有显著的差异。我们从Dyax噬菌体展示库中选取了两个hMAb产品（DX-M14和DX-P）并在两个多模式阳离子交换柱上测试了它们的载量，发现它在Protein A柱子的结合谱两个极端有着不同的载量。有趣的是，混合模式介质的载量对于具有类似于Protein A介质（表5）的IgG分子来说也是不同的，这表明结合特性与单个mAb分子的理化性质有关。 为了最大限度地提高混合模式层析捕获工艺的分离分辨率，我们通过对不同分离模式机理的研究，探索了一种提高产品质量的清洗和洗脱策略。增加缓冲液盐浓度将破坏离子相互作用的静电相互作用，同时增强多模态CEX介质的疏水性相互作用。相反，pH值增加和电导率降低的洗脱缓冲液会降低蛋白质和介质配体的表面电荷，同时减少疏水作用。实验结果表明，在低pH条件下仅增加缓冲盐的摩尔浓度，就可以得到一个聚体较少的产品池，说明通过疏水相互作用，聚体的保留能力更强(图10)。此外，发现以Capto MMC作为捕获介质时，Dyax 噬菌体展示库衍生出的mAb产品的解吸附需要在洗脱缓冲液中加入精氨酸，这意味着在抗体-介质吸附过程中可能会产生额外的氢键相互作用(数据未显示)。多篇文献报道了精氨酸在Capto MMC蛋白洗脱中的作用。因此，作为最关键的参数洗脱策略需要仔细设计，以获得用于混合模式捕获纯化过程的最佳纯化结果。一般来说，多模式阳离子交换捕获分离技术与前文述及的传统CEX捕获工艺相像，与中和的ProA洗脱池相比，在产品池中产生的可溶性聚体相对较少，但与宿主相关的杂质较多(表6)。 工艺效率和产品质量是驱动捕获介质选择和构建工艺操作策略的两个主要因素。上述研究对近年来单克隆抗体捕获技术的创新进行了评估。Protein A亲和层析是能够直接从复杂的原料中捕获抗体产品的唯一有效的分离技术。新一代Protein A介质具有更好的载量并能耐受氢氧化钠清洗，这使Protein A亲和层析仍然是mAb捕获工艺的首选。该平台捕获方法不仅提供了强大的分离能力，以及经过验证的洗脱后低pH病毒灭活程序，而且还提供了易于理解的制造控制过程参数，以及具有成功监管历史的直接开发路径。然而，在阳离子交换和混合模式层析介质设计方面的创新，已经提出了两种适合抗体捕获工艺可行的替代层析方法选择，尽管它们还没有达到取代Protein A亲和分离的程度。阳离子交换层析由于具有载量高和较低聚体生成的优点，在低pH洗脱条件下，对Protein A载量低或易于形成聚体的mAb产品来说是一种有吸引力的捕获工艺。调节pH是在生产规模上预处理CHO细胞培养收获液的一种常用方法，通过加入沉淀/凝聚剂来减少宿主细胞杂质成分。对收获液进行结合酸诱导的凝聚预处理和工厂设备中可用的在线稀释，阳离子交换层析能够在工业规模上实现，这已被Adalimumab (Humira)的制造工艺所证明。对于混合模式层析，多模式阳离子交换介质提供的载量可与进行最小进样操作的新一代Protein A介质相比。这似乎并不能在分辨能力方面优于mAb制造过程中Protein A亲和分离平台，但如果mAb产品有这样的需求，则可能为节省成本和额外的聚体水平控制提供潜在优势。此外，在其他重组蛋白捕获制造工艺中，若亲和层析难以实现，混合模式层析可能是一个非常有吸引力的工具。我们应用混合模式层析法从澄清的E.coli或HEK细胞培养上清液中捕获Fab和其他工程抗体片段产物，并获得了不错的纯化结果（数据未显示）。未来，随着全行业对高通量、低成本抗体药物生产的驱动，捕获分离技术的选择将真正取决于能否以最低的成本使工艺效率和产品质量最大化。 图1 Protein A纯化工艺低pH清洗 将Dyax hmAb DX-T1澄清CHO发酵培养液上样到具有20cm床高的Mabselect Protein A柱上，规定停留时间为2.5分钟。在用50mM的柠檬酸钠缓冲液、pH 3.4进行洗脱之前，先开发出一个低pH冲洗步骤(0.1M 柠檬酸钠 pH 4.0)，然后用50mM磷酸、pH 2.0进行洗脱。采用SEC-HPLC对洗涤，洗脱和清洁峰进行收集并分析。除宿主细胞相关杂质外，抗体片段富集洗涤峰、聚体富集在清洁峰。 图2A Protein A纯化过程洗脱pH优化 将Dyax hmAb DX-T1澄清CHO发酵培养液上样到具有20cm床高的Mabselect Protein A柱上，规定停留时间为2.5分钟。进行pH优化洗脱，宿主细胞源性杂质和抗体聚体富集在清洗峰。从左到右，洗脱pH分别设定为pH 3.2、pH 3.4和pH 3.5，导致聚体水平分别为5.6%、1.8%和1.2%。 图2B Mabselect和Mabselect SuRe洗脱特性 将Dyax hmAb DX-M14 CHO补料分批澄清培养液原料上样到新装的在预先确定的最佳上样量下具有相同的尺寸大小的Mabselect或MabselectSuRe柱子上。上样后，用1M氯化钠磷酸盐缓冲液在pH 7.4下冲洗柱子。然后用0.1M柠檬酸钠缓冲液在不同的pH 3.0、3.3和3.6下对DX-M14产品进行洗脱。结果表明，MabselectSuRe洗脱反应为全或全无模式，不适合对聚体分离。当用含18%聚体的澄清收获液得到相同的上样材料时，被用于Mabselect和MabselectSuRe柱，并在pH 3.4时用最佳缓冲液洗脱。在用于Mabselect ProA时，Protein A洗脱产物池中的聚体水平降低至约12％，而经过MabselectSuRe ProA的则无变化。层析图的A280线条揭示了Mabselect和MabselectSuRe工艺的不同产物洗脱和清洗峰模式。 图3 洗脱缓冲液对Protein A纯化过程中产品质量的化学影响 将Dyax hmAb DX-T1澄清CHO发酵培养液上样到具有20cm床高的Mabselect Protein A柱上，规定停留时间为2.5分钟。在相同的pH 3.2和相似的电导率～8 MS/cm的条件下，不同洗脱缓冲液从Mabselect柱子上洗脱抗体产物。层析图揭示了产品的洗脱模式受洗脱缓冲体系的选择影响。洗脱池中产品质量总结在表2中。A）0.1 M的柠檬酸盐洗脱缓冲液- AP1柱；B）0.1M醋酸盐缓冲液-AP微型柱；C）0.1M精氨酸缓冲液-AP微型柱；D) 0.1M甘氨酸缓冲液- AP微型柱。 图4 不同Protein A介质的洗脱产品池中浸出ProA和CHO HCP水平对比 Dyax hmAb DX-M14 CHO补料分批澄清的培养物原料上样到用五种不同商用Protein A介质装填的柱子（Mabselect-Resin A，MabselectXtra-resin B，MabselectSuRe-resin C，ProSep Ultra Plus-resin D和Mab capture Aresin E）。DX-M14产品以预先确定的最优上样量在每一种Protein A柱子上样，然后用同样的洗涤、洗脱和清洗工艺条件进行纯化。纯化后的洗脱产品池用0.2u过滤，再通过特异性杂质ELISA方法检测浸出Protein A和CHO HCP水平。 图5A 阳离子交换介质的动态载量 用DYAX HMAB DX-K1-CHO补料分批澄清培养料，测定了一组市售阳离子交换介质的动态载量。将Dyax hmAb DX-T1澄清CHO发酵培养液上样到具有10 cm床高的CEX柱上，规定停留时间为2.5分钟。收集流穿部分的样品，并通过Protein A-HPLC分析hMab含量。柱穿透率计算公式为（C/C0）X100（C和C0分别表示hMab上样和流穿时的浓度）。新一代CEX介质的载量明显提高，超过100mg／ml。 图5B 展示了进样pH和电导率对阳离子交换载量的影响。 将来自Dyax hmAb K1 CHO补料分批细胞培养液的Protein A纯化产物池分开并用1M Tris中和至pH 4、5、5.5和6。将中和至pH5.5的料液进一步分开并用1M氯化钠或WFI（注射用水）调节至预先确定的电导率3-4、7-9和12-14mS / cm。然后将调整后的样品直接上样在具有不同阳离子交换介质的床高约10cm的预装CEX柱上，规定停留时间为2.5分钟。收集流穿部分样品并通过A280分析hMab含量。柱穿透率计算公式为（C/C0）X100（C和C0分别表示hMab上样和流穿时的浓度）。 图6 pH和稀释度调整对mAb澄清收获培养液的影响 两种澄清Dyax hmAb：用1M乙酸调节pH和/或用WFI稀释的DX-M14和DX-P CHO补料分批细胞培养收获液。测量培养物上清液的浊度，用0.2u过滤的样品通过ProA-HPLC监测产物滴度变化。由于DX-P收获上清液样品能耐受pH调节，因此它们进一步受到稀释的挑战。拍摄照片以呈现样品浊度，并且hmAb滴度的变化以未调整的收获液滴度值的百分比表示。 图7 不同载量的CEX介质的阳离子交换柱洗脱DYAX HMAB的洗脱动力学 中和源自Dyax hmAb DX-K1 CHO补料分批培养液的Protein A纯化产物池，直接上样在具有约20cm床高度的不同CEX介质填充柱上，规定停留时间为2.5分钟。CEX介质分类为<40mg><70mg ml的中等载量cex介质和=""> 100mg / ml的高载量CEX介质。抗体DX-K1产物用含有预先确定的最佳氯化钠的50mM乙酸钠缓冲液在pH5.0洗脱。收集Fraction样品并通过A280分析hMab含量，通过SEC-HPLC分析聚体水平。洗脱峰的层析图见图8A。图8B和8C显示了整个洗脱峰的hmAb浓度动力学和聚体水平分布。
图8A CEX捕获工艺的pH分离策略 将Dyax hmAb DX-M12 CHO补料分批培养液的pH调节至6.0并将电导稀释至5-6mS / cm，然后上样到具有约20cm床高的POROS XS阳离子交换柱上，规定停留时间为2.5分钟。用pH 5.5的50mM乙酸钠平衡柱子。上样后，mAb产物立即用pH7.0的100mM柠檬酸盐-磷酸盐缓冲液洗脱。在再次平衡到上样条件之前，用洗脱缓冲液加0.25M NaCl第一次清洗，然后0.5M NaOH洗涤柱子。
图8B CEX捕获工艺的电导率分离策略 将Dyax hmAb DX-P CHO补料分批培养液在少量稀释的情况下调节pH至5.0以达到12 mS/cm的电导率，然后上样到具有约20cm床高的POROS XS阳离子交换柱上，规定停留时间为2.5分钟。用pH 5.0的50mM乙酸钠平衡柱子。上样后，mAb产物用含300mM NaCl的50mM乙酸钠在pH 5.0洗脱。用含1M NaCl的50mM Tris在pH7.8清洗，然后再用用0.5M NaOH清洗，最后再平衡回到上样条件。
图9 混合模式捕获研究 图9A展示了传统和多模式阳离子交换介质对原料电导率挑战的比较。将Dyax hmAb K1 CHO补料分批细胞培养液经Protein A纯化的产物池用1M Tris中和至预先确定的pH 5.5，然后用1M氯化钠或WFI（注射用水）调至导电率约为3,6和12 mS / cm。然后将调整后的样品直接上样在约10cm床高的预装CEX（Toyopearl GigcapS介质）或混合模式（Toyopearl MX-Trp-650M介质）柱上，并规定停留时间2.5分钟。收集流穿部分样品并通过A280分析hMab含量。柱穿透率计算公式为（C/C0）X100（C和C0分别表示hMab上样和流穿时的浓度）。 图9B显示了捕获工艺中三种不同多模式CEX介质的动态载量。滴度3.2 g/L的Dyax hmAb DX-P的澄清CHO补料分批培养收获液将pH调至5.5、电导率约12mS / cm，然后上样到填充的混合模式柱上。收集流穿部分样品并通过ProA-HPLC测定hMab含量。柱穿透率计算公式为（C/C0）X100（C和C0分别表示hMab上样和流穿时的浓度）。
图10 多模式阳离子交换工艺洗脱策略 将澄清Dyax hmAb DX-P CHO补料分批培养收获液的pH值调节至5.5，电导率为12-14 mS/cm，然后在预先确定的最佳结合条件下直接上样在装好的Toyopearl MX-Trp-650M混合模式柱上。比较不同的洗脱策略以寻找更好的产品质量。通过两种连续的洗脱方法洗脱mAb产物：用低pH缓冲液增加缓冲盐浓度（IEX方法）和用降低的电导缓冲液（HIC方法）增加pH以用于抗体产物解吸附。收集来自两个连续洗脱峰的样品并通过ProA-HPLC分析产量，SEC-HPLC分析评估聚体水平。 表1 不同Protein A介质在制造工艺中的载量比较
载量定义为：10%流穿时动态载量的80% 表2 DX-T1产品质量对比
将DX-T1澄清CHO补料分批细胞培养收获液上样到Mabselect Protein A柱上，在相同的pH 3.2和电导率约8 mS/cm下使用不同的洗脱缓冲液洗脱。 表3 捕获Dyax hmAb DX-K1的不同分离技术间动态载量对比
表4 Protein A和CEX捕获工艺效率对比
表5 Protein A和多模式CEX介质动态载量对比
表6 DYAX HMAB DX-P不同捕获工艺的代表性比较
a上样至≥90％柱容量时，单次SMB柱循环的产量。流穿池包含52％的Mab上样，将被下一步的Protein A柱捕获。 b将非Protein A捕获洗脱池进行缓冲液交换并上样到Poros 50 HQ柱上以确定随后的CHO HCP清除率。 c收获的上清液中含有由第三代Cygnus CHO HCP ELISA试剂盒测得的200,000ppm CHO HCP。 原文来源： |
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