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用腻了ceRNA，不妨试试lncRNA结合蛋白的套路。 lncRNA之所以在科研界炙手可热，是因为它有通天彻地之能，DNA、RNA、蛋白质均与它有着千丝万缕的关系，可介导胞内各种各样的生物学效应。lncRNA如此全能，甚至可媲美蛋白质，因而要研究lncRNA，一招移花接木，灵活套用蛋白研究思路，自然可以一步登天。 lncRNA调控的12种途径 众所周知，lncRNA对基因的调控可发生在基因水平、转录、转录后、翻译、翻译后这5个环节。而细分下来，这5个环节共包含了12种能够影响基因表达调控与功能的途径： 基因水平 1）lncRNA参与调节DNA甲基化，甲基化需要蛋白酶催化，lncRNA可以起到穿针引线的作用。 转录水平 2）&3）：lncRNA对转录因子以及其他转录调节蛋白的作用主要有两种：招募（recruitment）和抑制（inhibitor），需要依据具体情况来分析促进或抑制转录过程。 4）lncRNA转录后直接结合附近的DNA序列，抑制转录。该过程的特殊之处在于不依赖于蛋白，是核酸之间直接结合。 5）lncRNA可影响转录复合物以及RNA聚合酶的催化活性，进而影响转录过程。 6）lncRNA影响染色质结构的组蛋白修饰包括甲基化、乙酰化，进而调节转录过程。 转录后水平 7）lncRNA可结合mRNA影响可变剪切，即影响mRNA的前体加工成熟的过程。 8）mRNA加工成熟后需要转运到细胞质进行蛋白翻译，而mRNA的定位也会受到lncRNA影响。 9）mRNA的稳定性同样受到lncRNA调节。既可结合mRNA的3’UTR诱导mRNA降解（类似miRNA），也可结合蛋白，再靶向结合mRNA的序列，促进mRNA的稳定性。 翻译水平 10）lncRNA可以结合mRNA的5’UTR非翻译区，促进翻译过程；也可以结合特定的蛋白靶向mRNA，抑制翻译。 翻译后水平 11）lncRNA可调控蛋白翻译后修饰，比如可影响JAK-STAT信号通路的明星分子STAT3的磷酸化水平。 12）lncRNA还能调节蛋白的细胞定位，进而影响蛋白的功能。 lncRNA的四种模式 而依据分子作用的特点可对lncRNA作用机制进行进一步的浓缩简化，并提炼总结为signal，decoy，guide，scaffold四种模式。 1）signal：信号分子。相比于蛋白，lncRNA的调控效率显然要高。因为蛋白需要在编码翻译后，从胞浆再运送到细胞核内，才能参与转录调控；而lncRNA（如反义lncRNA、eRNA）转录出来后可以直接结合染色体中邻近位置的DNA调节基因表达，即顺式调控模式（cis-regulation）。 2）decoy：诱骗。上策所讲的ceRNA就是lncRNA发挥decoy作用的典型，属于RNA-RNA直接结合的decoy。lncRNA也可以decoy蛋白，比如可竞争性结合转录因子，抑制DNA的转录过程。 3）guide：引导。类似伴侣分子，在RNA-蛋白-DNA三元机制模式中，lncRNA结合转录因子后，可将该转录因子定位至特定的DNA上，从而调控下游分子的转录。Guide属于典型的反式调节作用（rans-regulation），因为lncRNA调控的是另外一个位置的基因。 而一般认为当lncRNA对100万碱基对距离（可人为缩小为20万或50万）之内的基因进行调控作用时，则属于cis调节。其实，signal和guide跟顺式反式并非有着绝对的对应关系。顺式、反式只看位置远近，signal、decoy、guide只看作用的特点。 4）scaffold：结构骨架，指的是一个lncRNA充当蛋白复合体的骨架，连接多个蛋白，归属于RNA和蛋白结合的范畴。Scaffold、guide、decoy均可以结合蛋白，其区别在于经典的Guide模式可以连接DNA，而scaffold没有结合DNA的戏，只结合蛋白；decoy竞争的蛋白，它本来是有一个其他的结合对象的，而scaffold模式中没有。 lncRNA-蛋白交互研究的实验方法 通常lncRNA作用机制的基本模式有两种：1）跟RNA交互以ceRNA为主流，2）找lncRNA的互作蛋白，一般lncRNA可以结合转录因子调控下游靶基因的启动子，构成RNA-蛋白-DNA的三元结合。 其中，RNA蛋白结合是目前lncRNA研究的重要机制方向，而且是高分文章的标配。而针对RNA-蛋白分子交互作用的两种不同情况可采用不同的实验方法。 1）从已知lncRNA找结合蛋白的实验方法主要是RNA pulldown，类似GST-pulldown，用带有生物素biotin的RNA探针来捕获lncRNA，然后用链霉亲和素（Streptavidin）的beads结合biotin，如此亲和层析后，换溶液洗脱下来的蛋白，可用质谱鉴定或WB验证。 2）而从已知蛋白找lncRNA的实验方法则是RIP，类似ChIP，用ProteinA的beads偶联抗体，抗体结合蛋白，蛋白把RNA沉淀下来，然后以测序/基因芯片高通量进行筛选，或用定量PCR进行验证。 而近年来，研究RNA蛋白结合的改进新方法也是层出不穷，如CLIP、ChIRP、CHART，它们的基本原理都是一样的：用生物素标记RNA，然后捕获蛋白，用测序分析RNA或质谱分析蛋白。 如果蛋白和RNA两个分子都已经锁定，验证彼此结合也可以用另一种常用的核酸与蛋白相互作用的研究方法：凝胶迁移实验（EMSA），该实验最初被用于验证转录因子与DNA相互作用。 此外，还可用蛋白芯片技术研究RNA-蛋白交互作用。通常一款蛋白组芯片上预制有大概2万种人全长蛋白质，只需要把lncRNA用化学合成或体外转录方法获取纯化出来，荧光标记后与芯片孵育杂交，而后分析芯片上哪个位置蛋白结合探针有荧光信号，就可以识别lncRNA的结合蛋白。如果是研究蛋白-蛋白相互作用，就加入标记的蛋白样品进行杂交，原理一样。 蛋白芯片已成为商业化的产品，好处是有公司服务，只要有lncRNA序列外包全套都能做下来，费用也还好。但是它是一种纯粹体外的结合体系，跟胞内情况可能会有不同，所以存在假阳性结果。基于此，在通过芯片找到互作分子后，仍需要提供经典实验（RIP、RNA-pulldown）的数据。 在此，推荐一个专门用来分析和计算蛋白与ncRNAs相互结合能力的数据库catRAPID，它可根据二级结构、氢键、范德华力等参数来预测蛋白-RNA的结合关系。 在catRAPID的模块中，catRAPID omics应该首先会用到。Omics可用于预测某一个lncRNA的结合蛋白，或者某一个蛋白的结合lncRNA，即只需知道lncRNA的核苷酸序列或蛋白氨基酸序列就可以了，circRNA也可以做。这个网站的其它模块主要是确定了特定的lncRNA和特定蛋白组合之后，来进行进一步分析评估两者间相互结合的效能。 lncRNA研究套路总结 目前大部分lncRNA的文章（包括circRNA）都是以筛选结果为起点的，并把经筛选确认了表达差异以及细胞定位的lncRNA分子，进行一正一反的功能验证以及细胞动物的二次验证。 接下来若只研究间接机制，找明星通路和明星蛋白进行二元或三元论证即可；而要做直接作用机制研究，则首先应确定该lncRNA的转录位置和亚细胞定位。 1）lncRNA定位于核内，先考虑附近的基因有没有表达受影响——signal模式。基于高通量测序的数据，分析lncRNA表达谱和mRNA表达谱的相关性，寻找顺式调控作用。 如果顺式作用无结果，可考虑反式作用调控基因。此时位置没有限制了，关键需要找结合的转录因子，套的是guide或者decoy的模式，研究蛋白-RNA相互作用（DNA甲基化酶、组蛋白、RNA聚合酶），根据RNA pulldown筛到的蛋白来具体展开。 2）lncRNA定位于胞浆，可以优先考虑ceRNA，不然就要考虑lncRNA结合蛋白的作用机制，或者考虑mRNA结合影响稳定性、可变剪切、调节翻译、介导翻译后修饰等角度。但不管是scaffold，guide还是decoy，研究RNA结合蛋白的实验方法从筛选到验证都一样。 综上，要想通过lncRNA、circRNA这些创新的分子类型，冲击高分文章，本策移花接木就值得各位学员反复品味。下策“阳奉阴违”将细述mRNA可变剪切的研究套路，敬请期待。 |
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