研究背景 恶性肿瘤是当前危害人类健康的重要疾病之一,是新世纪人类第一杀手,对人类生存构成最严重的威胁。目前较为成熟的治疗方法有手术治疗、放射治疗、药物治疗及免疫治疗四类。近几年来,肿瘤化疗取得了很大的进步,但对危害人类生命健康最严重的、占恶性肿瘤90%以上的实体瘤的治疗效果不尽人意;并且绝大多数抗肿瘤药物在抑制或杀伤肿瘤细胞的同时,对正常组织、器官不可避免地产生损害或毒性作用,给患者带来痛苦,甚至导致死亡。因此,开发与研究新型有效的抗肿瘤药物是生物医药科研领域的重大课题和长期任务。 我国的药用植物物种资源丰富,含抗癌活性成分的物种有200种左右,迄今已通过肿瘤细胞株及动物移植性肿瘤筛选的植物单体成分已超过4000余种。植物来源药物在化学结构和作用机制方面均具有多样性;同时,长期以来中医治疗肿瘤的研究已积累丰富的资料和经验,有助于开发和研制植物来源的抗肿瘤新药。因此,从天然药物中获取有效成分并以此为先导化合物是抗肿瘤药物研究和开发的重要途径之一。 胡桃醌(Juglone;Nucin)又名5-羟基-1,4-萘醌;5-羟基-1,4-萘二酮。是从胡桃楸新鲜根皮、枝皮、青果皮中分离出来的羟基萘醌类化合物,是胡桃楸中主要的毒性物质。在中国胡桃楸皮作为民间抗癌验方,历史悠久,作为胡桃楸的主要成分胡桃醌的抗癌活性研究也有报道。近年来有研究显示其具有抗真菌、抗衣原体或抗HIV病毒、抗癌、降血糖和杀虫等生物活性,越来越受到人们的重视。因此,进一步开发胡桃醌抗肿瘤活性,了解其作用机制,有着非常重要的现实意义。 目的 筛选敏感细胞株,探讨胡桃醌抗肿瘤作用的细胞学机制;在体实验考察胡桃醌抗肿瘤活性,并对其毒性进行评价;研究胡桃醌对肿瘤转移形成的影响;检测胡桃醌SD大鼠血浆蛋白结合率,为其机体代谢提供一定理论基础。 方法 1.采用MTT法测定胡桃醌对不同细胞株的生长抑制率,筛选敏感细胞株。 2.采用Flou-3/AM法检测胡桃醌对BEL-7402细胞内游离钙离子浓度的影响,通过流式细胞仪观察12.5μmol/L胡桃醌作用后细胞线粒体膜电势的变化、细胞周期分布及凋亡细胞比率,采用荧光偏振技术离体动态地检测30min内胡桃醌对BEL-7402细胞各向异性r、荧光偏振度mP和微粘度η的影响,分析细胞膜流动性的改变。 3.12.5μmol/L胡桃醌作用于BEL-7402细胞24h后固定,分别行HE染色、考马斯亮蓝染色和扫描电镜及透射电镜的样品制备。 4.200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L和12.5μmol/L胡桃醌作用于EAHY.926细胞株24h后MTT法检测细胞存活率,选用划痕法探讨胡桃醌对内皮细胞迁移的影响。采用大鼠主动脉无血清培养法,加入100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L和12.5μmol/L浓度的胡桃醌,观察其对血管内皮细胞爬行及其微血管结构形成的影响;选用7日龄鸡胚进行鸡胚绒毛尿囊膜血管生成实验,探讨胡桃醌对新生血管形成的影响。 5.采用人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,通过腹腔注射和局部注射两个给药途径进行胡桃醌药效学的研究。 6.采用小鼠B16/F10黑色素瘤人工肺转移模型研究4.5mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg和0.75mg/kg胡桃醌对肿瘤细胞血道转移的作用。 7.采用超滤法,通过高效液相(HPLC)考察胡桃醌的血浆蛋白结合率。 结果 1.不同类型的细胞株对胡桃醌的敏感性不同:人肝癌HepG2细胞株IC_(50)为10.93841μmol/L,人肝癌BEL-7402细胞株IC_(50)为14.66485μmol/L,人乳腺癌MCF-7细胞株IC_(50)为20.788μmol/L,人肺癌A549细胞株IC_(50)为24.41432μmol/L,人鼻咽癌CNE2细胞株IC_(50)为25.3178μmol/L,人宫颈癌HeLa细胞株IC_(50)为27.90769μmol/L,。 2.100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L胡桃醌均可抑制人肝癌BEL-7402细胞的生长,诱导其凋亡,IC_(50)为13.78μmol/L。25μmol/L、12.5μmol/L胡桃醌作用BEL-7402细胞株24h后行PI染色,结果显示有明显的凋亡峰出现;同时存在明显的细胞碎片峰。而胡桃醌作用HepG2细胞株24h后行PI染色,结果显示只有明显的细胞碎片峰,而无凋亡峰出现。胡桃醌作用于BEL-7402细胞4h后线粒体膜电势降低,提示BEL-7402细胞已经开始凋亡级联反应。400μmol/L、200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L、25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L胡桃醌均可引起BEL-7402细胞膜的r、mP和η值显著性降低(P＜0.05),尤其在最初1min内r、mP、η值下降迅速,1min后各指标下降的趋势渐渐平缓。不同浓度的胡桃醌作用BEL-7402细胞30min后未见胞内Ca~(2 )浓度发生改变,结果提示胡桃醌可能通过Capase途径诱导细胞调亡。 3.12.5μmol/L胡桃醌作用BEL-7402细胞24h后细胞形态和细胞骨架均发生改变。扫描电镜结果显示BEL-7402细胞胞体体积缩小,与周围细胞群脱离,表面微绒毛卷曲、畸变、小球结构逐渐增多,细胞间连接逐渐断裂,细胞间隙增宽,有凋亡小体形成。透射电镜结果显示,细胞微绒毛消失,膜完整,胞核浓集,异染色质增多,内质网扩张,线粒体疏散、轻度肿胀,嵴消失。 4.200μmol/L、100μmol/L和50μmol/L浓度胡桃醌对EAHY.926有明显的抑制作用(P＜0.05),IC_(50)为122.848μmol/L;25μmol/L、12.5μmol/L和6.25μmol/L的胡桃醌促进EAHY.926细胞株的生长(P＜0.05)。1 00μmol/L、50μmol/L和25μmol/L的胡桃醌均可抑制大鼠主动脉微血管形成(P＜0.01),12.5μmol/L的胡桃醌可明显减少内皮细胞的爬行数量,延缓其爬行速度(P＜0.01)。200μmol/L、100μmol/L、50μmol/L及25μmol/L胡桃醌作用于鸡胚绒毛尿囊膜,其血管呈现现不同程度的充血、出血,甚至凝血,呈剂量依赖性;各组胡桃醌作用区域均无新生血管形成。 5.以600μg/kg、300μg/kg和150μg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,NK细胞活性检测发现,600μg/kg、300μg/kg胡桃醌组裸鼠NK细胞活性较正常对照组低(P均＜0.01),150μg/kg胡桃醌组的NK细胞活性与正常对照组无显著差异(P＞0.05);但600μg/kg胡桃醌组NK细胞活性与阳性对照组(5-Fu)相似(P＞0.05)。结果提示胡桃醌对小鼠免疫系统有一定的损伤作用。但600μg/kg、300μg/kg和150μg/kg胡桃醌对肿瘤生长没有明显的影响(P均＞0.05)。 不同PH(PH=7.4、PH=4.0)600μg/kg、300μg/kg和150μg/kg胡桃醌对人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型局部给药,结果发现不同PH值的600μg/kg、300μg/kg胡桃醌局部注射抑瘤作用与空白对照组相比存在显著差异(P均＜0.05),而与阳性对照组(5-Fu)组相比无显著差异(P＞0.05);同一浓度不同PH胡桃醌间的抑瘤作用无显著差异(P＞0.05)。 以4.5mg/kg、3mg/kg和1.5mg/kg胡桃醌腹腔注射于人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤模型,结果发现4.5mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg胡桃醌的肿瘤抑制率分别为78.24%、66.57%、48.94%;4.5mg/kg、3mg/kg胡桃醌的抑瘤作用可与阳性对照组相当(P均＞0.05)。但4.5mg/kg胡桃醌组裸鼠出现明显的皮下脂肪减少、消瘦,并有死亡现象。 6.4.5mg/kg、3mg/kg、1.5mg/kg和0.75mg/kg胡桃醌对小鼠黑色素瘤B16F10血道转移抑制率分别为27.30%、55.35%、31.52%和25.34%;3mg/kg胡桃醌抑瘤率与阳性对照组相当(P＞0.05)。而4.5mg/kg胡桃醌抑制率低可能是由于该剂量胡桃醌降低机体免疫功能造成的。 7.胡桃醌SD大鼠血浆蛋白结合率为90.92%。 结论 1.胡桃醌能有效抑制人源肿瘤细胞增殖;但细胞株类型不同,其敏感性不同。 2.胡桃醌能有效改变人肝癌BEL-7402细胞亚显微结构,诱导细胞死亡。 3.胡桃醌能显著增加BEL-7402细胞的膜流动性,促进药物进入细胞内部,提高药物对细胞的毒性。 4.胡桃醌具有抗血管生成作用。 5.胡桃醌可抑制小鼠黑色素瘤B16F10血道转移。 6.胡桃醌可抑制人肝癌BEL-7402细胞裸鼠皮下移植瘤的生长。 7.胡桃醌血浆蛋白结合率高,导致其需较高浓度才能发挥其抗肿瘤效果。……
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