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【摘要】：目的：
研究猪苓对J774巨噬细胞M1/M2表型及炎症细胞因子表达的调节作用,并探讨其与MAPK信号通路的关系。
方法：
1.体外培养小鼠巨噬细胞系J774细胞；
2.MTT比色法检测不同浓度猪苓对J774细胞活力的影响,了解猪苓对细胞是否具有细胞毒作用,通过此细胞毒实验筛选后续实验中猪苓溶液的用药浓度；
3.利用IFN-γ诱导J774巨噬细胞为M1型巨噬细胞,real time PCR检测猪苓对iNOS mRNA的影响；利用IL-4诱导J774巨噬细胞为M2型巨噬细胞,real time PCR检测猪苓对Arg-1mRNA表达的影响；
4.real time PCR检测猪苓对正常J774细胞及LPS诱导的J774细胞炎症细胞因子IL-1β, IL-6, IL-10mRNA表达的影响；
5.用LPS刺激J774细胞,Griess法检测不同浓度猪苓对一氧化氮(NO)释放的影响；real time PCR检测iNOS mRNA表达的影响；
6.用LPS刺激J774细胞,Western blot法检测LPS启动MAPK信号通路的时效关系及猪苓对LPS诱导的J774细胞MAPK信号通路中P-38MAPK及Erk蛋白磷酸化表达的影响,推断猪苓是否通过MAPK信号通路来影响炎症因子的分泌。
7.本研究中所有实验结果均采用均数±标准差(x±s)表示,采用方差分析比较实验中多个样本均数差异的显著性。以统计软件SPSS18.0进行方差齐性检验,在方差齐性前提下通过one-Way ANOVA分析进行各处理组样本均数间的多重比较,以P0.05代表差异具有统计学意义。
结果：
1.MTT比色法得到,在0.05-5μg/ml剂量范围内,猪苓处理组细胞存活率与空白对照组相比差异无统计学意义,猪苓对J774细胞活力无明显影响,在此剂量范围内的猪苓对J774细胞不具有细胞毒性,可以选取此剂量作为后续实验剂量。
2.经IFN-γ刺激后,iNOS mRNA的表达量较空白组上升,差异具有显著统计学意义(P0.01)；加入各浓度猪苓共处理后,猪苓能够抑制由IFN-γ引起的iNOS的高表达,且iNOS mRNA的表达量随着猪苓浓度的增加而降低,具有剂量依赖性,与IFN-γ处理组相比,猪苓低剂量组无统计学差异,猪苓中高剂量组有显著统计学差异(P0.01)。IL-4刺激J774细胞后,Arg-1mRNA的表达量较空白组上升,差异具有统计学意义；加入各浓度猪苓共处理后,Arg-1mRNA的表达量随着猪苓浓度的增加逐渐升高,具有剂量依赖性,与IL-4处理组相比均具有统计学意义,其中中高剂量组较IL-4处理组差异显著(P0.01)。
3.猪苓单独作用J774细胞时,对J774细胞IL-1β, IL-6, IL-10mRNA的表达无明显影响,数据经统计与空白对照组无统计学差异。当用LPS刺激J774细胞时,可显著促进J774细胞IL-1β, IL-6, IL-10mRNA的表达,与空白对照组相比较差异显著(P0.01)。猪苓给药处理后,IL-1β和IL-6mRNA的表达与LPS处理组相比受到明显抑制,并随着猪苓剂量的增加抑制率越强,差异显著；另外一方面,猪苓处理组IL-10mRNA的表达高于LPS处理组,且低剂量猪苓促进作用较高剂量强,差异具有统计学意义。
4.加入LPS刺激之后,NO表达量显著增加,与空白对照组相比,具有明显的统计学意义(P0.01)；与空白对照组相比,猪苓各剂量组单独作用于J774细胞所产生的NO降低,其中猪苓中高剂量具有统计学差异,猪苓低剂量组无统计学差异；猪苓各剂量组与LPS共同作用能够降低由LPS引起的NO高表达,差异具有显著统计学意义(P0.01),其中以中剂量组抑制作用最为明显。另外,LPS处理组iNOS表达量显著高于空白对照组(P0.01),加入各剂量猪苓处理后,iNOS表达量降低,与LPS处理组相比差异具有统计学意义,且此抑制作用具有剂量依耐性,低剂量组猪苓抑制iNOS释放更明显,随着猪苓剂量的增加,抑制作用下降。
5.LPS刺激J774细胞30min.6h.24h时,P-38和ERK磷酸化蛋白的表达量显著高于空白组,以30min时的表达量最高,随着刺激时间的延长其表达量降低；选取30min为给药刺激时间,加入猪苓与LPS共同处理后,猪苓能够显著抑制由LPS引起的P-38和ERK磷酸化蛋白的高表达,与LPS对照组相比差异具有统计学意义(P0.05)。
结论：
猪苓能抑制LPS引起的M1巨噬细胞相关因子IL-1β,IL-6的表达,下调-氧化氮及活性氧表达；同时促进M2巨噬细胞相关因子IL-10的表达,说明猪苓可以抑制LPS引起的过度炎症反应,而在生理模型时,猪苓对上述因子无影响,表明猪苓对免疫具有双向调节作用,其调节作用可能与MAPK信号通路中p38和ERK磷酸化蛋白的表达有关。
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