老基因如何发高分文章？

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这篇前列腺癌基础研究文献在2018年6月发表于Journal of Clinical Investigation（2018年最新IF=13.251）。首先根据我们经典的临床疾病基础科研ABCD四要素模式，我们来解读一下题目：TRAF4-mediated ubiquitination of NGF receptor TrkA regulates prostate cancer metastasis。题目依然是A基因通过B信号通路在C疾病中发挥D功能的经典模式。

目的基因TRAF4，已在多篇文献中被报道与不同肿瘤的恶性增殖与转移相关，包括肺癌、乳腺癌、结直肠癌等。甚至，在前列腺癌中，TRAF4基因已被报道在发生转移的前列腺癌病例组织中表达更高（在前列腺癌中功能未被报道）。综合文献检索结果，似乎TRAF4基因的创新性不是很高了，如何打好反击牌呢？且看文献中作者组织的具体研究思路。

首先，在临床相关性验证中，作者通过自己收集的临床病理样本（Fig. 1A, 1B）及大数据库样本检索（Fig. 1C-1F），确认了相比癌旁组织样本而言，在前列腺癌肿瘤组织样本中，TRAF4基因表达水平更高；并且发生了转移的病例组织样本中，TRAF4表达水平进一步增高（Fig1）。

Fig.1

Tips

对于临床样本获取比较困难的老师，大数据库样本挖掘是非常好的补充材料，可以为自己的少量临床样本检测结果锦上添花，互相印证。

其次，作者通过RNAi技术，在前列腺癌细胞中敲减TRAF4表达水平后，检测了细胞的体外转移、侵袭能力改变。并通过尾静脉转移成瘤模型，体内验证了敲减TRAF4表达水平后，细胞转移能力降低（Fig2）。

Fig.2

接下来，就是第三步机制研究。为了验证TRAF4发挥促转移功能的具体机制与其RING结构域相关，作者构建了野生型TRAF4过表达载体，以及缺失了RING结构域的TRAF4过表达载体，确认了TRAF4的RING结构域与促转移功能相关（Fig. 3A）。

为进一步研究TRAF4促进转移的机制通路，作者使用了抗体芯片，检测TRAF4过表达后下游通路基因的表达变化，进而确定了下游通路基因TrkA。敲减TrkA基因同样具有抑制前列腺癌细胞体内体外转移能力的功能(Fig 3C, 3D)。

Fig.3

为研究TRAF4蛋白与TrkA蛋白之间的关联，作者通过co-IP实验验证了TRAF4蛋白可以与TrkA蛋白直接结合(Fig 4A, 4C)。由于TRAF4是一个E3泛素连接酶家族成员，因此作者验证了TRAF4对于TrkA蛋白的泛素化水平影响，并确认了TRAF4促进TrkA蛋白的27号与29号赖氨酸的泛素化（Fig. 4B, 4D-4F）。

Fig.4

随后，作者验证了目的基因TRAF4与TrkA蛋白可分别促进肿瘤转移相关蛋白的表达水平（Fig. 5）。

Fig.5

就以上的结果而言，TRAF4的机制研究基本已阐明的比较明确了，即TRAF4通过影响TrkA蛋白泛素化水平，进而影响转移相关蛋白的表达水平。

然而作者并未停止。

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