qPCR冷知识：探针的荧光和淬灭基团怎么选？

在你做qPCR之前，如果你打算用探针法，那必须先确定，你做的这个探针的荧光和淬灭剂。

当然，可能你觉得SYBR Green更方便，但实际上SYBR Green的非特异性扩增，是它最最致命的弱点。而探针法的特异性，要比SYBR Green不知道高到哪里去了。但是探针法仍然有它的问题，那就是不一定所有的仪器都兼容。

这一点比较明显的就是多重的PCR中ABI的仪器是不能使用ROX这个荧光探针的，因为ROX在ABI的仪器中都要做为基底对照荧光。当然，还有些ABI的仪器机型是不支持特别多的通道的，这就会造成比较大的影响：

图片来源：https://eu./pages/education/decoded/article/qpcr-probes-selecting-the-best-reporter-dye-and-quencher

除了这一点，还有一点需要注意的就是VIC这个荧光，由于涉及到专利问题，所以很多人会用Hex替代，但实际上HEX和VIC之间还是有一定差异的（特别是，如果你打算用双荧光来做SNP位点检测的话就要慎选了）。于是，就可能导致使用VIC的探针和HEX的探针，在ABI的仪器上测出来的荧光强度会稍显不同（其他牌子的机型好像分不太出来）。当然还有一款叫Yakima Yellow的替代品，可以代替VIC，但这就需要慎重选择淬灭基团了。

当然，除了荧光基团的筛选，更重要的是筛选TaqMan探针的淬灭基团。比如，尽量不要选TAMRA作为淬灭基团。

为啥？因为TAMRA本身就是一个荧光基团，虽然它也有淬灭作用，但会加强本底荧光强度。当然还有，可能你也分不清BHQ1和BHQ2有啥区别。主要是因为在常用的荧光基团中，它们的淬灭作用基本相同，都能灭了Fam和HEX，但如果涉及到其他荧光基团的TaqMan探针的时候，记得要慎选：

图片来源：https://www./molecular-biology/real-time-pcr/dual-labeled-fluorescent-probes/tamra-quencher