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原文链接： https://www./articles/s41388-018-0400-3 许多癌症中可观测到Notch信号通路的过度激活和细胞的缺氧应激反应。两者的信号调节有交叉，目前普遍认为缺氧信号可调节Notch信号，但不知道Notch信号是否可以调节缺氧信号。瑞典卡罗林斯卡学院的Mutvei等近日报道了Notch信号可控制缺氧应激的核心调控因子——HIF2α的表达，证实了Notch信号可以从这一节点调控癌细胞的缺氧应激反应，包括乳腺癌细胞、肾癌细胞、神经管瘤细胞等。该研究近日发表在Oncogene上，可为未来的癌症治疗提供一些理论帮助。 细胞信号通路的失调与肿瘤形成紧密相关。Notch通路是多细胞生物中常见的、高度保守的、基于细胞间通讯的信号调节机制。Notch接收器是横跨细胞膜的跨膜蛋白，配体与其胞外结构域的结合将激活Notch通路，引发Notch接收器被剪切和其胞内结构域 （Notch ICD）被释放。Notch ICD随后迁移至细胞核，与CSL（RBP-Jk）和MAML（Mastermind-like）蛋白结合成具有转录激活活性的三元结构、诱导下游基因表达。 缺氧诱导因子（HIF）是细胞缺氧应激反应的核心调控因子。在含氧量正常的情况下，对氧敏感的脯氨酰羟化酶将HIFα（包括HIF1α和HIF2α）维持在羟基化状态，并通过E3泛素酶VHL的泛素化诱导蛋白酶体降解。HIF1α和HIF2α结构相近，但功能稍有不同。前者更多地控制糖酵解相关基因，在神经管细胞瘤中，HIF1α迅速积累且调控缺氧的急性应激反应。后者更多地调控与细胞迁移和侵袭相关的细胞间质金属蛋白酶，HIF2α在神经细胞瘤中晚一些积累且调控缺氧的慢性应激效应。HIF1α可经由信号开关转变为HIF2α。 缺氧状态下，Notch信号可被诸多机制上调，如HIF1α直接稳固Notch ICD、以及缺氧导致的Notch配体增加等。而卡罗林斯卡学院课题组的研究则证明了Notch反过来也可以调控缺氧应激反应，其机制与调控HIF2α表达有关；且同时说明了Notch诱导的转录组表达需要HIF2α。他们的主要发现如下。 1.Notch在多种癌细胞中上调了HIF2α的mRNA水平 对比多个转录组发现，Notch信号激活时HIF2α的mRNA水平较高，而Notch信号封闭时较低。含氧量正常的条件下，在测试的9种培养的癌细胞系中，Notch信号的上调了8种的HIF2α mRNA表达。在利用人类乳腺癌细胞系MDA-MB-231进行的研究中，通过固定Notch的配体Jagged1或Dll4均可增加HIF2α的mRNA表达，而γ分泌酶DAPT可抑制这一作用。由此可见，Notch可诱导HIF2α 的mRNA表达，且这一作用的实现需要Notch ICD 的释放。后续实验中，Notch的激活（配体激活或增加ICD表达）同样上调了原代人癌细胞的HIF2α的mRNA水平。 缺氧条件下，通过Jagged1激活Notch也诱导了乳腺癌细胞系和原代人乳腺癌细胞中HIF2α的mRNA表达、且可被γ分泌酶DAPT抑制，这与含氧量正常条件下类似，Notch通过Notch ICD 的释放诱导HIF2α mRNA表达。相反地，Notch信号不影响HIF1α的mRNA表达。而缺氧会导致乳腺癌细胞系中HIF1α的mRNA减少。 统计学分析表明，HIF2α与Notch的配体Jagged1的表达在所有被分析的肿瘤类型中都显著相关，包括肾癌、乳腺癌、乳导管癌、成神经细胞瘤、成神经管细胞瘤等。而HIF1α与Jagged1则不在任何肿瘤类型中显著相关。 图1 Notch信号激活了HIF2α的表达 2.Notch常规通路可调控HIF2α的表达，但却并非通过HIF2α近端启动子 为明确HIF2α的激活是否需要Notch1 ICD迁移至细胞核，研究者们短暂表达了一个Notch1 ICD接收器和雌激素接收器的复合结构NERT2。NERT2可在加入抗雌激素他莫昔芬的情况下从细胞质迁移到细胞核。结果表明：在成神经管细胞瘤和乳腺癌细胞系中，细胞质中的NERT2表达不会促进HIF2α及其下游标志基因NRAPP的表达，但他莫昔芬诱导的NERT2迁移至细胞核可显著上调两者的表达。dnMAML的表达可拮抗他莫昔芬（通过NERT2）对HIF2α和NRAPP的上调作用，表明Notch的常规通路可对HIF2α实现调控。通过CRISPER/Cas9使CSL失活也减少了Notch对HIF2α的上调。 作者进一步研究了Notch上调HIF2α的机理：是通过直接与HIF2α启动子结合，还是通过间接方式。染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）发现，CSL在Notch激活时未与HIF2α启动子及基因结合，而是与HES1启动子上的一个常见位点结合。同样地，在荧光素酶报告基因测验中，Notch的激活并不激活HIF2α启动子区。然而，采用蛋白翻译抑制剂环己酰亚胺（CHX）来阻隔Notch激活时发现，CHX处理抑制了依赖于Notch激活的HIF2α表达，但Notch下游基因NRARP不受影响。而更生霉素(actinomycin D) 则同时抑制了Notch对HIF2α和NRARP的激活。上述结果表明， Notch ICD/CSL通过激活一个可上调HIF2α表达的中间蛋白来控制HIF2α，而非直接与HIF2α启动子结合。 图2 常规Notch 通路可调控HIF2α表达，但并非通过直接的转录激活 3.上调的Notch信号提升了HIF2α蛋白水平，刺激了HIF1α向HIF2α转换 含氧量正常的情况下，HIFα因子处于被降解的状态。但基于激活Notch诱导了HIF2α 的mRNA表达，研究者们设想HIF2α的蛋白表达也会增加。在乳腺癌、成神经细胞瘤、髓母细胞瘤和VHL缺陷肾癌细胞系中的试验证实，含氧量正常的情况下，异常的Notch1 ICD 表达会导致Notch信号的高度激活，从而提升HIF2α蛋白水平。Notch激活HIF2α的活性在其同源蛋白中高度保守：Notch2和Notch3也对HIF2α有上调作用。 配体调控的Notch激活相对缓和。含氧量正常的情况下，24小时配体激活可增加培养的人乳腺癌细胞中的HIF2α蛋白含量，但72小时处理无效；并且也对原代人乳腺癌细胞无效。而缺氧条件下，培养的乳腺癌细胞和原代人乳腺癌细胞中均能观测到配体诱导的HIF2α蛋白含量增加。在乳导管癌和髓母细胞瘤细胞中，通过二氯化钴模拟缺氧环境也能观测到类似结果。 不论是否缺氧，Notch激活导致多种癌细胞中HIF1α蛋白水平下降，包括乳导管癌细胞和原代乳腺癌细胞。上述现象在较长的处理时间才能观测到，说明Notch诱发的HIF1α向HIF2α转变需要一定时间。在一系列控制HIF1α向HIF2α转变的开关蛋白中，编码HIF1α降解相关泛素连接酶的CHIP蛋白被Jagged1轻微上调、并被DAPT显著下调，由此推测CHIP是Notch和HIF1α之间的信号中介。 图3 Notch 信号增加了HIF2α蛋白表达，及HIF1α向HIF2α转换 4.Notch诱导的转录组中的部分mRNA依赖于HIF2α表达 HIF2α是转录因子，研究者们认为Notch诱导的转录组应该包括Notch ICD 和HIF2α 共同激活的目标。为找出HIF2α特异的基因，研究者们先测试了与缺氧和HIF2α相关的两个基因VEGF和AREG，二者均可被Notch上调且上调作用可被DAPT拮抗。 为宏观评估HIF2α对基因表达的影响，研究者们通过他莫昔芬在稳定表达NERT2的癌细胞中激活了Notch1信号，并通过siRNA对HIF2α及HIF1α进行基因敲减。基因组范围的RNA测序结果表明： 激活Notch在含氧量正常的情况下上调了1062个基因，在缺氧条件下上调了881个基因；在缺氧和非缺氧条件下都被Notch上调的基因有547个。含氧量正常的情况下，HIF2α siRNA的敲减作用下调了1062个基因中的227个基因（约21%），而HIF1α siRNA的敲减作用仅下调了44个Notch激活的基因（约4.1%）。约4.7%的基因同时被HIF1α和HIF2α调控。功能注释基因本体的富集分析显示， Notch激活且依赖于HIF2α的这227个基因与恶性肿瘤形成过程中涉及的机制——如细胞黏着、血管增生和信号转导等密切相关。 qPCR证实了上述基因中的三个代表——Notch3、TGFB2和ID3在含氧量正常的情况下诱导Notch表达，HIF2α siRNA可拮抗这一反应。类似地，在HIF2α 被敲除的细胞中，他莫昔芬激活Notch1 ICD 无法再上调TGFB2和ID3的表达；且相对于siRNA敲减HIF2α的模型，Notch3的上调也显著减少。
图4 Notch诱导的转录组中的部分目标表达依赖于HIF2α。 5.Notch同源接收器在成神经管细胞瘤生长中的特异效应。 研究者们测试了Notch和HIF2α信号变异对髓母细胞瘤细胞形成肿瘤能力的影响。尿囊膜移植模型表明 Notch2 ICD 、而非Notch1 ICD促进了肿瘤生长。采用CRISPER/Cas9抑制Notch1或Notch2而分别制造的癌细胞系中，抑制Notch1的癌细胞与对照细胞系相近，而抑制Notch2的癌细胞生长显著减少。转录组分析表明166个基因在抑制Notch1及抑制Notch2的两种癌细胞系中均上调，541个基因仅在抑制Notch2的癌细胞中上调，349个基因仅在抑制Notch1的癌细胞中上调。195个基因在上述两种癌细胞系中均下调，270个基因在抑制Notch2癌细胞系中特异性下调，825个基因在抑制Notch1癌细胞系中下调。 在NERT2表达的髓母细胞瘤细胞的HIF2α阳性或HIF2α阴性细胞中，他莫昔芬诱导的Notch1 ICD增加特异性抑制了HIF2α阴性癌细胞的快速生长，但不影响HIF2α阳性癌细胞的生长（仅上调NOTCH3和HEY）。Notch1而非Notch2缺陷会导致大量基因异常，表明存在Notch1特异的生长抑制基因，且它们仅在HIF2α缺乏时发挥作用。 此外，在缺氧条件下，HIF2α阴性细胞中HIF1α蛋白水平较高，采用HIF1α抑制剂KC7F2减少了对照及Notch1 ICD激活组中的肿瘤生长。上述试验同样证明了HIF2α导致HIF1α增加。 讨论 Notch和缺氧信号的失调将导致肿瘤的发生、发展。在缺氧信号可调控Notch信号这一理论被普遍接受的情况下，该文的主要贡献是证明了Notch信号反过来也调控了HIF2α驱动的缺氧应激反应。 研究证明Notch可在转录水平上调HIF2α、且必须与MAML1和CSL形成复合结构才能发挥作用，但该复合物不激活HIF2α近端的启动子。由此可见，Notch诱导的的HIF2α激活需要一个中间蛋白（待鉴定），该蛋白的合成优先于HIF2α的上调。 在含氧量正常的情况下，HIF2α蛋白通常处于被降解状态，但HIF2α mRNA的上调导致了几种肿瘤细胞中HIF2α蛋白的积累。HIF2α 的积累水平与Notch信号诱导相关，在缺氧和含氧量正常情况下，Notch诱导均可增加HIF2α；但配体诱导不足以在含氧量正常的情况下增加HIF2α，仅能在缺氧情况下增加HIF2α。这说明含氧量正常的情况下，充足的HIF2α mRNA完全可应付泛素化调节的降解。 研究发现，HIF2α的激活伴随着HIF1α的减少。这可能是由于Notch激活促进了HIF1α向HIF2α转变。该转变的机制尚不明确。第一个解释是Notch诱导的HIF2α增加引发了HIF1α的减少，这符合部分试验结果，但HIF2α激活带来的HIF1α减少并未在所有细胞中观测到。另一个解释是HIF1α减少引起了HIF2α增加，或者其它解释如HIF2α和HIF1α是独立调节的。由于Notch调控HIF2α表达，第一个解释最有可能。该文还发现Notch激活会通过CHIP引起HIF1α降解。关于Notch作用于HIFα转换开关的机理 、以及在不同细胞中的特异性还有待研究。 通过基因组范围的转录组分析，该文发现含氧量正常情况下约21%的基因表达需要HIF2α。比较保守的解释是Notch上调了HIF2α，并因此激活了其特异性基因。该现象与Notch和转录因子cMyc的交互作用类似。HIF2α特异的Notch转录组子集为癌症治疗提供了新思路。例如通过阻断HIF2α来减少Notch信号失调的不良影响。 小结 Notch在乳腺癌、肾癌和神经管细胞瘤中上调了HIF2α的转录。而HIF2α蛋白水平的上调伴随着HIF1α的下调，因此作者推断Notch信号可作为一个HIF1α到HIF2α的转换开关。在转录组水平，约21%（227/1062）的Notch诱导基因表达需要HIF2α。该研究证实了Notch通过增进HIF2α表达来调节缺氧应激反应，为肿瘤细胞中Notch信号和缺氧应激信号的交互作用提供了新的角度。   |
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