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利用单细胞质谱技术，来自斯坦福大学的Paul Utz, Purvesh Khatri, Alex Kuo课题组合作发现，染色质信号可以用于预测免疫细胞的细胞身份（cell identity）；在衰老过程中，个体间与细胞间的染色质信号的异质性增加；通过对双胞胎的研究发现，衰老过程中的染色质信号异质性主要由环境因素（而遗传因素）导致（图1）。该研究发表在Cell上。 全文链接： https:///10.1016/j.cell.2018.03.079 图 1单细胞质谱：免疫细胞与衰老过程的表观遗传学变化 真核生物的DNA缠绕着组蛋白八聚体，而组蛋白上发生的多种化学修饰，以及多种组蛋白变体，可以改变染色质结构、招募不同的识别蛋白，进而调控基因表达、DNA修复、DNA复制等过程。
对这些表观遗传学信号进行研究的手段多种多样，如ChIP-seq可以研究组蛋白修饰、组蛋白变体或转录因子在整个基因组上的分布位置，但一次只能研究一种蛋白或修饰。而质谱则可以同时研究多种组蛋白修饰、组蛋白变体等的丰度。在免疫细胞分化过程中，以及衰老过程中，利用质谱对表观遗传学信号的动态丰度进行研究，有助于我们发掘这些过程中关键的表观遗传学信号。 一、技术说明 常规的质谱打组蛋白修饰的变化，一般至少需要1万个细胞。而本文却可在单细胞层面进行研究。这得益于他们开发的EpiTOF技术（epigenetic landscape profiling using cytometry by time-of-flight）。简而言之，该技术首先用抗体增加灵敏度，然后又用重金属标记抗体，将细胞气化后留下金属离子，用TOF质谱打重金属（而非肽段），进一步增加了灵敏度，从而做到了单细胞分辨率。
技术细节： （1）将70种抗体（包括22类免疫细胞的表面marker抗体，8类组蛋白修饰的抗体，4种组蛋白变体的抗体）都标记上镧系元素同位素（可能因为镧系元素有非常多的同位素，可以同时标记很多种抗体；它们拥有相似的化学性质，标记抗体的能力相似；并且它可能更容易耦合抗体）。 （2）将细胞与重金属同位素标记的多种抗体共同孵育，洗去非特异结合抗体。 （3）将单细胞用电感耦合等离子体气化，只留下金属离子，并过滤留下100Da以上的重金属离子，进入飞行时间质谱仪（TOF-MS）。 （4）利用离子在电场中的飞行时间，计算质荷比（m/z），从而分析出每个细胞的镧系元素离子的类型、丰度，进而得知细胞类型（通过免疫细胞的表面marker抗体），以及组蛋白修饰和组蛋白变体的丰度。
质谱流程图见图2。 图 2 质谱流程图 （图片来自bitesizebio.com）
在抗体选择上，研究者检测了150多种chromatin marks的抗体的特异性，用RNAi敲低或CRISPR敲除表观遗传修饰的酶，或者用小分子药物抑制表观遗传修饰酶的活性，然后用流式细胞术检测组蛋白修饰的抗体的特异性，最终得到了40种特异的组蛋白修饰（图3C），将其加上镧系元素同位素标记做EpiTOF。研究者还用组蛋白H3的核心体抗体，以及H4 tail抗体作为背景对照。此外又用22类免疫细胞的表面marker抗体做细胞分型。共使用70种抗体。（文末附好用抗体列表。） 二、健康人免疫细胞的表观遗传学特征 研究者选取了24位健康人（CMV阴性）的外周血单核细胞，分为两组作为生物学重复，每组有25岁以下的3男3女，和65岁以上的3男3女。两组的人口统计学特征相同。对他们的免疫细胞经过EpiTOF分析，可以看到不同类型的免疫细胞具有不同的表观遗传学特征（图3C）。
首先，髓系和淋系免疫细胞拥有很大的差异。髓系CD14+单核细胞的大部分染色质修饰的水平都比淋系高，尤其是cleaved H3 Thr22（H3尾巴可在Thr22处被酶切，切掉前21个氨基酸，快速去除组蛋白修饰）和蛋白质精氨酸脱亚氨酶PADI4（催化组蛋白精氨酸脱亚氨化/瓜氨酸化，调控干细胞多能性）。而淋系免疫细胞拥有更高的H3.3和H3K27me3水平。
在淋系免疫细胞中，CD4+T细胞和CD8+T细胞的染色质修饰很相似。而NK细胞的绝大部分染色质修饰都很低。
在个体差异的分析中，虽然个体的基因背景差异很大，但染色质修饰的个体差异不大（通过Inverse Simpson’s Diversity Index计算）。其中个体差异最大的是H3K14ac，cleaved H3 Thr22和H2A.Z。个体差异最小的是macroH2A，PADI4，H2BK120ub。 （个体差异较大可能因为基因背景，生活环境与生活方式等的差异，也可能因为该修饰本身不稳定。而个体差异小则可能因为该修饰是组成型存在的，在不同个体中被稳定地调控，也许有稳定的调控作用。）
为验证EpiTOF的结果，研究者用FACS分选出单核细胞，B细胞，T细胞进行western blot，发现染色质修饰的水平差异与EpiTOF相符（图3D）。
图 3 各类型免疫细胞的染色质修饰谱 | PBMC：外周血单核细胞（髓系）；CLPs：共同淋巴祖细胞；CMPs：共同髓系祖细胞。
值得注意的是，T细胞和B细胞（淋系）的H3K27me3水平高于髓系单核细胞，研究者又分析了Corces et al., 2016的RNA-seq结果[1]，发现共同淋巴祖细胞的EZH1和EZH2（催化产生H3K27me3，参与转录调控）水平高于共同髓系祖细胞。结合ChIP-seq与RNA-seq分析发现H3K27me3淋系比髓系高的基因，表达水平淋系低于髓系。这个发现支持了H3K27me3参与调控造血干细胞向髓系与淋系不同方向分化的假说，H3K27me3的差别在淋系与髓系祖细胞中就已出现。 三、用染色质修饰模式预测免疫细胞的细胞身份 我们常说各种表观遗传学信号组成了“表观遗传学风貌（Epigenetic landscape）”，参与决定细胞命运。那么用本文中的40种染色质修饰信号，能否区分出免疫细胞的细胞身份（cell identity）呢？
下面，研究者将40种染色质修饰平均分成两个panel（图3B），用主成分分析（PCA, Principal Component Analysis）算法，将每个panel的20种染色质修饰的数据降维成3维信息。这里可以简单理解成，20种染色质修饰的数据是一个20维的图形，但我们是没法看到20维的图形的，所以就寻找它的3维投影，看哪个投影可以最大程度地把各个点区分开，最大程度地减少失真。最后得到的3维投影的XYZ轴，是20种染色质修饰数据的3个不同的线性函数。这三个函数可以最大程度地区分各个样品，提取其主要特征。虽然失真不可避免，但由于提取了主要特征，便于后面的计算和分析。
PCA结果见图4A，上下图是两个不同的panel的染色质修饰的结果。在图中，我们可以看哪些点聚集到了一起，这些点是否具有某些共同的性质。可以看到，不同类型的免疫细胞被很好地区分开了，同类细胞聚到了一起。其中骨髓来源的单核细胞与淋系免疫细胞区别很大。此外，两个panel的染色质修饰均有较好的区分度（图4B，4C。AUC越接近1，区分度越好）。24个个体分成的2个生物学重复，也具有很好的重复性（图4B，4C）。
图 4 染色质修饰可以用于预测免疫细胞的细胞身份 | （A）上下为两个panel的各20个染色质修饰的PCA结果。左图为PCA计算后的三维图，每个点是一个细胞，右图为不同类细胞的染色质修饰差异，单核细胞与其它细胞有较大差异。（B）用第一组个体计算的AUC，两个panel的染色质修饰均可很好地区分细胞身份。（C）用第二组个体的数据验证第一组个体的PCA函数的结果，发现细胞身份的区分度也很好，说明重复性好，该PCA函数可用于预测细胞身份。
如果再多看一些细节，研究者发现T细胞的各个亚群也拥有不同的组蛋白修饰特征（图5A，5B，5C）。 表达αβ TCR的T细胞与表达γδ TCR的T细胞拥有不同的组蛋白修饰谱（图5A左）。 Naïve T细胞被聚成了一类，而效应T细胞和记忆T细胞则与naïve T细胞有很大差别（图5A，5B）。 记忆T细胞有更多的活跃修饰，如H3S10ph, H3K27me1, H3K36me1，以及更低的异染色质修饰水平。说明记忆T细胞可能有更开放的染色质环境（图5B）。 与总的CD4+T细胞相比，Treg细胞有更高的H3K27me1和H3K27ac，更低的H3K27me3。这也支持了前人研究发现的H3K27修饰对Treg细胞功能的重要作用[2]（图5C）。
而NK细胞的两个亚群也拥有不同的染色质修饰模式（图5D，5E）。 NK细胞可用CD56分为两类，一类是主要发挥细胞杀伤作用的CD56dim NK细胞，约占90%。另一类是主要分泌细胞因子的CD56bright NK细胞。研究者发现，用染色质修饰同样可以把NK细胞分为两类，并且与CD56的分类相符（图5D）。两类NK细胞的具体的染色质修饰的差别见图5E。 图 5 T细胞和NK细胞的不同功能亚群具有不同的染色质修饰谱 | （A）不同T细胞亚群的染色质修饰谱，最左边是聚类情况，右边是热图，颜色越红水平越高，点越大，个体差异越小。（D）CD56分类的两个NK细胞亚群拥有不同的染色质修饰谱，图中每个点是一个NK细胞，按CD16和CD56分为左上角和右下角两类，颜色表示染色质修饰降维成PC1的强度，可以看到和CD56，CD16分类的情况相符。
以上研究证明了染色质修饰可以很好地区分免疫细胞的细胞身份，支持了业界长久以来的认识。同时也为免疫细胞的功能与表观遗传学调控间的关系提供了研究基础。 四、衰老过程中染色质修饰的细胞间与及个体间差异增大 首先，研究者发现衰老个体的造血输出减少，免疫细胞功能受损，CD45RO+记忆T细胞增多，这与前人的研究相符[3]。然后，对65岁以上老人和25岁以下年轻人各12人的20种免疫细胞的40种染色质修饰进行分析（图6A），利用PCA算法降成2维，可以代表72.7%的数据差异，可以将年轻人与老年人的特征分开，而不同性别则没有明显差异。结果发现，年轻人染色质修饰的个体间差异更小，而老年人的染色质修饰谱则非常离散，个体间差异很大（图6B）。但两者的组蛋白H3和H4的水平并无明显区别，主要是修饰的区别。
将对比老年人和年轻人的各类型的免疫细胞，染色质修饰也有很大差异（图6C）。可以看到，老年人的大部分类型的免疫细胞，大部分染色质修饰都均多于年轻人。但CD45RO+CD197+中央记忆CD8+T细胞是个例外。它的绝大部分组蛋白修饰都低于年轻人（图6C），这是由于其组蛋白H3和H4水平降低。 图 6 老年人免疫细胞染色质修饰的个体间差异更大
如果对比老年人和年轻人的染色质修饰的细胞间差异，可以看到老年人的细胞间差异更大（图7A）。 其中，在衰老后，由PRC1，PRC2介导的组蛋白修饰（H3K27me3，H3K27me2，H2AK119ub）的细胞间差异最大（图7B）。 那么衰老前后的染色质修饰与转录水平有何关系呢？研究者尚未进行人的单细胞RNA-seq，于是他们分析了前人做的年轻和衰老的小鼠的naïve CD4+T细胞的ChIP-seq和单细胞RNA-seq结果[4]，发现H3K27me3标记的基因在衰老后有更大的转录异质性，而H3K4me3标记的基因则没有。 图 7 衰老后染色质修饰的细胞间差异增大
这些数据提示，在衰老后，染色质修饰的噪音/异质性的上升（尤其是PRC介导的H3K27me3），将导致细胞间染色质状态的差异与转录噪音的增加。
五、衰老后的染色质信号差异增大，主要受环境因素（非遗传因素）影响 为了研究衰老后的染色质修饰谱变化，到底更受遗传因素还是非遗传因素影响，研究者选取了9对同卵双胞胎（基因组100%相同）和10对异卵双胞胎（基因组50%相同）进行研究（图8A），并且对比随机选取的非双胞胎个体对的数据，检测双胞胎与非双胞胎在衰老后的变化有无差异。
首先，与上文的研究相符，年老的双胞胎也有更高的染色质修饰异质性，并且中央记忆CD8+T细胞的染色质修饰水平在衰老后下降。
利用经典ACE模型[5]分析遗传因素对衰老后各类型细胞的染色质修饰差异的影响，发现遗传因素只能解释30%的差异，而非遗传因素可以解释70%（图8B）。
根据PCA分析，年轻的双胞胎的染色质修饰谱更接近（双胞胎组内与组间个体都很接近）。而年老双胞胎的个体间差异增大（双胞胎组内与组间个体的差异都很大）（图8C）。
对比双胞胎与非双胞胎的数据，发现无论是否是双胞胎，染色质修饰谱的异质性都会在衰老后增大，提示衰老后的异质性增大可能更受非遗传因素影响（图8D）。 进一步研究发现，年轻个体的染色质修饰谱的异质性，同卵双胞胎 < 异卵双胞胎=""><>（图8E上），表明年轻时的染色质修饰谱可能更受上一代给予的遗传信息（包括遗传学或表观遗传学信息）的影响。 而年老个体，无论是同卵双胞胎、异卵双胞胎，还是非双胞胎，其染色质修饰谱的异质性都差不多大（图8E下），表明衰老后的染色质修饰谱可能更受非遗传因素影响（包括环境因素，及体细胞突变影响） 为了进一步增强结论，研究者对同卵双胞胎进行了研究，发现尽管同卵的两个双胞胎从上一代获得的遗传信息相同，大部分染色质修饰（32/40）都是只在年轻的双胞胎中相似，而年老后异质性增加。这进一步说明了衰老后的染色质修饰异质性增加主要由非遗传因素影响。 图 8 非遗传因素可以解释衰老前后大部分的染色质修饰谱的差异 | （B）大部分的染色质修饰的差异受非遗传因素影响。横轴为20种免疫细胞，纵轴为40种染色质修饰（按受遗传因素影响从强到弱排序），颜色表示可以解释遗传或非遗传因素可以解释的染色质修饰差异的程度，70%的深色的点都是非遗传因素影响的。（C）年轻与年老的双胞胎的染色质修饰的PCA分析，年老的双胞胎个体间差异更大。（D）和（E）是每对双胞胎内，或随机配对的两个个体间的染色质修饰的个体差异。（F）是每对同卵双胞胎的两个个体间，年轻VS年老个体的染色质修饰的相关性。每个点是一种染色质修饰。大部分的点在左上角，说明大部分的染色质修饰都是在年轻的双胞胎中更相似，到了年老就不相似了。 延伸思考
好用的抗体列表 参考文献 [1] CORCES M R, BUENROSTRO J D, WU B, et al. Lineage-specific and single-cell chromatin accessibility charts human hematopoiesis and leukemia evolution[J]. Nat Genet, 2016,48(10):1193-1203. [2] LI Q, ZOU J, WANG M, et al. Critical role of histone demethylase Jmjd3 in the regulation of CD4+ T-cell differentiation[J]. Nat Commun, 2014,5:5780. [3] WERTHEIMER A M, BENNETT M S, PARK B, et al. Aging and cytomegalovirus infection differentially and jointly affect distinct circulating T cell subsets in humans[J]. J Immunol, 2014,192(5):2143-2155. [4] MARTINEZ-JIMENEZ C P, ELING N, CHEN H C, et al. Aging increases cell-to-cell transcriptional variability upon immune stimulation[J]. Science, 2017,355(6332):1433-1436. [5] RIJSDIJK F V, SHAM P C. Analytic approaches to twin data using structural equation models[J]. Brief Bioinform, 2002,3(2):119-133.  |
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