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生物药市场中约40%的为单克隆抗体（mAbs），单抗因而成为驱动生物制药工艺经济增长的一类主要分子。虽然氨基酸序列决定了蛋白的生物活性，但大多数会受翻译后修饰的影响。翻译后修饰如脱酰胺、二硫键形成、末端赖氨酸处理（切除）和糖基化，后者是一种发生在内质网和高尔基体内复杂的翻译后修饰。根据作用机理，生物药物分子的糖型可能决定了其临床疗效，因此糖基化修饰被认为是单抗药物的一个关键质量属性（CQA）。单抗产品通常由哺乳动物细胞表达，往往可以发现糖基化修饰存在批间差异。因此，生物药物分子在药学及临床研究评价阶段，需要对这种差异性的可接受范围进行限定。一旦商品化生产，蛋白药物成功的一个先决条件就是产品质量一致性，而糖基化的监测与控制可确保产品质量的一致性。 已知的，糖基化修饰可以促进单抗产品的稳定性和可溶性，并且可以减缓形成聚体的趋势。抗体糖型的异质性是生物制药产业一个明显的挑战。免疫球蛋白分子构象不仅由其多肽序列决定，而且受糖链与多肽及糖链之间相互作用的影响。糖型受宿主细胞酶催化机制、高尔基体内转运时间、环境因素和所能获得糖核苷酸影响。多因素相互作用使得各生产批次糖型几乎不可能相同，即使同一制造商使用相同的设备和工艺过程。 本文将概述各环境因素对单抗药物糖型的影响，描述Fc片段糖基化的结构异质性，并探讨各类糖基化在单抗药物效应子功能中所扮演的角色。既然抗体糖基化研究会横跨上游过程的多个领域，我们在本文中将关注与培养过程相关的糖基化，培养所产生的糖型多样性和它们在抗体效应子功能中所扮演的角色。并就该话题前景做进一步的讨论。 抗体是可溶性血清糖蛋白，在体内产生并对外源性病原体进行免疫应答。在人体中，有5种类型的免疫球蛋白存在：IgM，IgA，IgD，IgG和IgE（图 1），其中IgA和IgG根据在血清中的相对浓度又可分别分为2种和4种亚型。目前所有获批的重组单抗药物都是lgG型抗体，其中IgG1型抗体在血液中占主导地位。如图 1所示，一个IgG分子包含两条重链和两条轻链，他们通过共价和非共价形式联合在一起，形成了两个与抗原反应的Fab片段和一个Fc片段。 图1 不同类型的免疫球蛋白，IgA、IgG、IgD、IgE和IgM示意图，（---）表示各区域或单体间连接的二硫键。（●）表现与免疫球蛋白区域相连接的糖基化结构。 Fc片段通过活性区域与受体相结合发挥效应子功能。人类具有多种效应子配体，包括FcγRs（FcγRI，FcγRIIa，FcγRIIb，FcγRIIIa和FcγRIIIb），新生儿Fc受体（FcRn）和补体级联反应中的C1q补体。IgG的N-糖基化位于Fc片段的CH2区的共有序列（Asn297-X-Ser/Thr，X可以是除脯氨酸的任意氨基酸残基），通过酰胺键与抗体共价结合。通过晶体X衍射发现蛋白与糖以对等方式相互作用而影响彼此构象。除了Fc片段糖基化外，30%的IgG在Fab片段存在N-糖基化，对抗体分子的功效产生有益、有害或中性影响。Fc糖基化糖分子具有复杂的双天线型核心结构，该结构由甘露糖（Man）和N-乙酰葡糖胺（GlcNAc）两种戊糖分子组成，不同糖型除核心结构外还另外含有不同数目的糖分子，如岩藻糖（Fuc），甘露糖，N-乙酰葡糖胺，半乳糖（Gal），二等分N-乙酰葡糖胺和唾液酸（Sia）（图 2A）。糖链的长度、分叉型式和单糖序列的变化导致了糖基化修饰的复杂性。另外由于各种酶的原因使得N-糖基化的五糖核心结构分为三类：高甘露糖型、杂合型和复杂型（图 2B）。一些商品化单抗的不同糖型及其相对丰度详见表 1。 IgG通过糖基化修饰的重链CH2区与Fc受体和C1q补体结合形成免疫复合体，从而分别发挥抗体依赖的细胞介导的毒性作用（ADCC）和补体依赖的细胞毒性作用。IgG的N-糖基化修饰始于内质网（ER）中将一个脂连寡糖（LLO）转至多肽链Asn297上，然后一步步进行反应。由于多聚糖的多样性导致了微观异质性（聚糖的种类）和宏观异质性（聚糖所在位置）。聚糖的微观异质性取决于个体生物的种属、年龄、性别和健康情况。糖型随着诸如癌症、风湿和炎性疾病发生而变化。蛋白药物的糖型影响生物过程的很多方面。因此，监管机构基于制造商展现出的确保糖基化修饰一致性的能力而发放批文。 图2 免疫球蛋白Asn297位糖基化修饰的聚糖分子结构异质性示意图 表1 一些商品化各糖型图示举例，根据它们相对丰度排列（1st>2nd>3rd>4th） 糖基化水平可以促进或消除抗体的效应子功能。CH2区的N-糖基化存在不同程度的异质性。以下我们将简要讨论对抗体效应子功能的影响。 岩藻糖核心寡糖是在转运高尔基体中，通过-1,6-岩藻糖基转移酶从GDP-Fuc上转运来的岩藻糖残基生物合成而来。通过具有岩藻糖和无岩藻糖修饰的Fc片段结构分析表明：两者间Asp280和Asn297残基的电子密度存在差异；Tyr296残基的水合模式也存在差异。Lec13突变细胞表达的无岩藻糖修饰的人IgG表现出：与FcγRIIIa亲和力提高50倍，ADCC作用提高100倍。无核心岩藻糖使得FcγRIIIa受体中Asn162与Fc聚糖具有更高亲和力，因而结合更强。而岩藻糖的空间位阻会阻碍这种相互作用。考虑到岩藻糖残基对ADCC作用的影响极大，已经研发出降低IgG（仅不足10%的重组IgG是非岩藻糖糖基化的）岩藻糖糖基化的策略。这些策略包括构建缺少或减少-1,6-岩藻糖转移酶的细胞系；或过表达β（1-4）-N-乙酰葡糖氨基转移酶III基因（GnTIII），使用糖苷酶抑制剂kifunensine，且/或通过锌指调节沉默岩藻糖转移子基因。 糖修饰中糖链末端的半乳糖苷对抗体效应子功能的影响相对而言所知较少。有发现半乳糖苷的存在可以增强CDC效应。通过糖苷酶处理去除半乳糖后发现会降低补体溶解活性。由中国仓鼠卵巢（CHO）细胞生产的嵌合型单抗RituximabTM，与C1q的结合（CDC活性）据知会受到Fc糖基化修饰末端半乳糖苷的影响（2倍的差异）。CH2区构象因末端半乳糖变化，从而与FcγR的结合力增强。研究者已经展示了高半乳糖基化和无岩藻糖基化相对天然IgG对ADCC活性具有叠加效应（78倍）。半乳糖基修饰的增加使得Fc结构中的CH2区空间距离增加，暴露出更多的可与FcγRIIIa结合的氨基酸。与老鼠骨髓瘤细胞相比，CHO细胞表达的抗体半乳糖基化修饰程度低，并且据报道末端半乳糖修饰是抗体特异性的。虽然对于半乳糖基化修饰的作用理解还处于初期，但是生产中还是需要确保其受控。 血清中糖蛋白的半衰期与唾液酸化水平有关，唾液酸化糖蛋白可被肝脏中特殊受体从循环系统中有效清除。然而，唾液酸修饰不影响IgG的循环半衰期。末端通过-2,6连接的N-乙酰神经氨酸（Neu5Ac）对静脉注射的免疫球蛋白（IVIGs）的抗炎活性犹如开关一般。据知，含末端唾液酸的比不含唾液酸的IgG对蛋白酶更敏感。因为与FcγRIIIa亲和力降低，及不溶性或与细胞表面抗原结合能力可能受到影响，高唾液酸水平的突变IgGs的ADCC活性表现下降。大量的Neu5Ac基团可降低铰链区的柔性，导致ADCC活性和抗原结合力下降。分泌表达唾液酸酶A的宿主细胞产生的无唾液酸糖基化修饰的抗体展现出很强的ADCC活性。这点也已经被锌指核酸酶技术改造过的CHO-gmt5细胞系所证实，该细胞系缺失CMP-唾液酸转运子。唾液酸化对抗体既有正向亦有负向作用，因此控制唾液酸化程度对ADCC活性和抗体结构稳定性很关键。 末端GlcNAc残基可提高CH2区的热稳定性。去除这些残基会发现热稳定明显变差，与可溶性FcγRIIb的亲和力略有下降。含末端GlcNAc的IgG显示具有更长的血清半衰期。 表达GnTIII基因的工程细胞系将二等分GlcNAc加到双天线结构上，使得抗体的目标杀伤浓度较未改造抗体的低10-12倍。加入二等分GlcNAc的抗体与FcγRIIIa的亲和力增加，从而提高了ADCC活性。然而，这点也可认为是由于降低了核心1,6-岩藻糖的空间位阻所致。 Fc片段糖基化异质性相当一部分体现在末端甘露糖数目，例如：Man5GlcNAc2、Man6GlcNAc2、Man7GlcNAc2,Man8GlcNAc2、Man9GlcNAc2和Glc3Man9GlcNAc2。含高甘露糖残基的IgG分子血清半衰期较短。有很多文献证实，寡聚甘露糖类在人血浆中快速被清除。由FUT-8突变细胞系生产的高甘露糖型和杂合型甘露糖基化修饰的IgG显示出比复杂糖型修饰的IgG更高的清除速率。矛盾的是，在鼠中的药代动力学显示复杂糖型和高甘露糖型修饰的单克隆抗体（mAb）分子的血清半衰期没有显著差异。在另外一个研究中表明血清清除与聚糖切除有关，而与聚糖结构无关。 在非还原端具有半乳糖残基的mAb分子由于与C1q亲和力下降，显示出CDC活性降低。另一方面，这些分子与FcγRIIIa亲和力升高，显示出ADCC活性提高。这个可能与核心结构中没有岩藻糖有关。在重组抗体中，细胞系和培养环境的变化会导致甘露糖型的差异。因此，考虑到末端甘露糖残基对mAb药物的药代动力学的显著影响，其应该被考虑作为关键质量属性（CQA）。 mAb产品的糖型与其所表达培养的条件有着错综复杂的关系。已知的，包括宿主细胞类型、培养基和培养过程控制参数在内的一些因素对糖型具有显著影响。不同培养条件的影响详见图 3。按照质量源于设计（QbD）理念，各种条件如何影响细胞生理状态从而影响产品的质量需要更为深入的理解。 因为糖基转移酶和糖苷酶在内质网和高尔基体中线性排列的不同，所以不同宿主细胞系表达的mAb糖型存在差异。上述酶在上述细胞器中的浓度与分布决定了分泌表达的mAb糖基化情况（图 4）。mAb产品的生产主力是哺乳细胞系，包括CHO，幼鼠肾（BHK）细胞，人胚肾（HEK293）细胞，人胚成视网膜（PER.C6）细胞和白血病（NMF-9）细胞系。其他用来生产生物药的细胞系有如NS0，SP2/0和Y0。尤其CHO细胞系通常被用作生产，因为它可以很好的生长，所得抗体糖型稳定且与人细胞的相似。CHO细胞系与人细胞就唾液酸与半乳糖的连接方式存在差异，CHO细胞缺少-2,6唾液酸转移酶，仅产生-2,3连接的唾液酸苷；而人细胞同时存在-2,3&-2,6连接的唾液酸苷且更倾向于后种连接方式。缺少-2,6连接的唾液酸影响mAb分子的循环生命周期。另外一个显著差异是缺少GnTIII功能酶，从而无法产生二等分GlcNAc残基的。NS0细胞会产生-1,3半乳糖表位和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）而非（Neu5Ac）这样微观异质性。这会增加使用这类药剂病人的免疫原性。因而表达mAb的宿主细胞的选择对产品质量影响明显。对13个不同种属来源的糖型回顾性研究分析显示，末端半乳糖，二等分GlcNAc和岩藻糖有变化。甚至不同细胞系的不同克隆间的糖型也有不同，寡聚甘露糖5结构的变化改变效应子功能的同时加速了抗体的清除速率。相同的研究发现，细胞培养方式由分批式变为流加式糖型发生了变化。然而，培养规模从400L扩大至5000L时糖型仍保持一致。由此得出结论：生物反应器的类型和培养模式很大程度上影响了终产品质量。 图3 哺乳细胞糖基化途径中各种酶和糖-核苷酸前体受各种培养参数影响的示意图。培养参数包括（1）温度，（2）谷氨酰胺，（3）溶氧，（4）葡萄糖水平，（5）氨浓度，（6）细胞系（野生型或工程改造型），（7）细胞活力，（8）锰离子，（9）丁酸钠，（10）核苷酸糖，（11）DMSO，和（12）pH值。 酵母表达系统（酿酒酵母和毕赤酵母）作为可选择的表达系统，但没有与人类似的修饰糖型。酵母细胞缺少许多高尔基系统中的转移酶，且表达的重组蛋白高甘露糖基化。为了消除这些约束，已经对酵母细胞（P.pastoris）的糖基化反应路径进行工程改造，引入类似人类的翻译后修饰。据报道，用糖工程改造过的毕赤酵母表达的人IgG产量达1.4g/L，远超过传统的哺乳细胞表达系统。然而，应用到抗体生物生产中依然存在一些主要缺陷，包括偶然地引入异质的O型连接聚糖和N型聚糖结构差异。 昆虫细胞为融合蛋白表达提供了另外一个强大平台。昆虫细胞系如草地贪夜蛾卵巢细胞系（SF9或SF21）和粉纹夜蛾胚胎细胞系（BTI5B1-4），据报道在高尔基体表面缺少转运蛋白，阻碍了核苷酸糖的转运，从而使得寡糖链形成过程不完整。昆虫N型聚糖通常为由岩藻糖取代通过-1,3-和-1,6-与最基端的GlcNAc相连的少甘露糖型或者为高甘露糖型。虽然植物细胞表达类似的酶，植物的N型聚糖含有β-1,2-木糖和-1,3-岩藻糖，会引起免疫原性且在动物研究中引起反应。 图4 不同表达系统和人类细胞中不同N-聚糖结构示意图 众所周知，抗体糖型取决于培养基中各营养物质浓度，营养物质中的糖分子作为糖基化所需的糖-核苷酸前体存在培养基中。培养基中葡萄糖水平变化明显影响聚糖异质性，在流加模式中更为重要，产品糖型的一致性是获得临床预期结果的保障。已发现，随着葡萄糖浓度的提高，CHO细胞及新近构建的细胞系（如F2N78）所表达的抗体半乳糖和唾液酸糖基化水平会提高。在最近发表物中，研究了葡萄糖和谷氨酰胺对细胞生长的作用，检测mAb产率和糖基化水平，发现可利用的葡萄糖在决定半乳糖和唾液酸糖基化水平中扮演了一个重要角色。在流加试验中间隙停止葡萄糖的补料会导致副产物的产生并且预期的糖基化水平会下降。培养基中葡萄糖浓度（0-25mM）时，会观察到葡萄糖饥饿使LLO产生速率变慢，导致占位减少和非正常糖结构产生。在低葡萄糖水平时，细胞将葡萄糖专门用来满足能量需求而不是补充给糖基化前体。这样使得糖-核苷酸库的不平衡，导致出现非预期的糖型。 利用多通道技术，通过限制葡萄糖饥饿和培养持续时间，发现葡萄糖合适的操作区间浓度（2-8g/L）。葡萄糖饥饿程度在培养早期对细胞影响最大。在该阶段，大多数的控制蛋白分泌和糖基化的调控蛋白处于高水平表达，流加营养对核苷酸前体产生的作用也与之前观察一致。在一个流加培养的生物反应器中添加8种不同营养物质，实验发现半乳糖，Neu5Ac和甘露糖引起糖-核苷酸前体的变化从而调整了糖型。 在无血清收获周期中，向培养基中补充添加氨基酸的同时添加二价阳离子如Mn2+（4-40μM）可以发现产物的半乳糖苷化和唾液酸化提高。因为Mn2+是高尔基体中β-1,4-半乳糖苷转移酶的辅助因子。二价阳离子在分泌路径将寡糖连接至目的物中发挥作用，没有它们N型连接寡糖链过程将会受到抑制。高浓度Mn2+（16μM）存在时，将葡萄糖用其他糖替换如半乳糖，会发现甘露糖型（32%）水平升高。高浓度Mn2+存在，同时补充尿苷和半乳糖，则发现mAb的半乳糖修饰水平增加。在一个设计试验的研究中发现仅存在Mn2+无法获得最大程度的半乳糖修饰，核苷酸糖前体半乳糖和尿苷的协同作用是必须的。 众所周知，丁酸钠可以通过将细胞周期滞留而增加特定mAb的产率，然后，在培养基中加入丁酸钠观察到会降低半乳糖修饰水平并增加mAb的碱性电荷异构体。添加丁酸钠也观察到会降低mAb唾液酸修饰水平，尽管该结果不明显。 单糖连接至正在成长的天线寡糖链结构中需要核苷酸糖作为供给者，其效率对最终糖型影响极深。尿苷被认为是合成糖-核苷酸结合体的主要前体之一，因此影响产品质量。 由于安全性及监管问题，在细胞培养基中避免使用含血清成分物质。然而，无血清驯化费时且会导致糖型多样化，建议在过程早期对产品质量进行监控。培养基中补充的氨基酸对唾液酸修饰的影响已被很好地证明。氨基酸的消耗直接与表达的抗体所序列所含氨基酸种类相关。因此为了获得最佳产品质量，在培养过程中补充关键氨基酸并进行浓度分析是势在必行的。这些还引导出了新的词汇如“fermentanomics”的出现，利用1D1HNMR技术实时或近似实时监控补料成分与细胞代谢。利用多重变量数据分析评估mAb糖基化与过程变量及诸如氨基酸等原材料的关系，从而对复杂糖基化过程产生更为深入的了解。 影响细胞生长及产品质量的最为关键参数是培养温度。最优的培养温度可能不一定是生产融合蛋白的最优温度。低些的培养温度（从37℃降至30-35℃）发现可以使细胞滞留在G0/G1期，具有更高的细胞活力和更少的细胞凋亡。在低的温度下发现细胞内UDP-GlcNAc和UDP-GalNAc数量减少。研究者证实mRNA水平的提高（而非生长周期的滞留）是低温下获得高产率的背后原因。最近，通过关键糖分支酶的研究对低温条件下的mAb产品有了更好的了解。发现这些酶下调导致终产品糖链结构的异常。 所有代谢过程都需要氧气，所以溶氧控制对优化细胞生长很重要。观察到细胞表达的糖蛋白/抗体糖型的随溶氧（DO）水平变化而改变。在鼠CC9CC10细胞表达的IgGmAb1时发现半乳糖基化水平的差异，低溶氧条件下半乳糖糖基化水平也低。这个似乎是因UDP-Gal低水平所致，因为葡萄糖分解途径导致半乳糖利用率下降。另外一个解释是早期形成的重链间二硫键对要加入正在生长的寡糖链的半乳糖产生了空间位阻。不同型号的生物反应器，即使达到相似的过程控制和溶氧条件，依然会对糖型有影响。利用杂交瘤细胞系（BCF2）进行一室缩小规模模拟溶氧张力（DOT）波动培养，研究生物培养环境的差异对mAb糖型影响。据报道，10%DO水平下培养三天线结构和唾液酸数量会增加。DOT对鼠杂交瘤细胞系HFN7.1生产的IgG1的糖型影响极深，DOT在10%-90%空气饱和度变化时，半乳糖和唾液酸最大变化量分别达20%和30%。短暂的DOT变化对终产品质量有着显著影响。 氨是CHO细胞代谢谷氨酰胺或天冬酰胺时释放到培养基中的有毒副产物。据知，氨水平的增加会改变CHO细胞表达的IgG的糖型，因为铵根离子会升高高尔基体的pH值并抑制与寡糖链相关的酶的酶活。对mAb生产而言，理想的胞内氨浓度低于2mM，胞外浓度4-10mM。高尔基体pH的微小上升会导致-2,3-唾液酸转移酶定位错误，维持pH近中性会改变高尔基体的形态。高pH会影响UMP的电离状态，UMP是一种UDP-GlcAc转运子的逆向转运物质，从而影响UDP-GlcNAc转运进高尔基体。氨水平的增加同样显示出：高尔基体高pH时，引起半乳糖和唾液酸修饰的降低，从而引起甘露糖修饰的增加。氨也通过补偿胞内核苷酸糖库的平衡而影响抗体糖型（图 3）。已有推论因为CMP-SiaT酶水平的降低，氨水平的提高阻止了唾液酸从胞质转运到高尔基体。更进一步，从可用文献获知pH（理想pH6.8-7.8）对糖型的显著影响与不同表达细胞系有关，另有结果表明pH在不同细胞系中对糖型的微观异质性有影响。还有些研究者报道称人细胞系中高pH会引起半乳糖修饰水平下降，另外一些人发现杂交瘤细胞系中高pH引起IgG3的半乳糖修饰水平增加。 渗透压是另外一个影响mAb生产、细胞生长和细胞活力的关键过程参数。一定范围的高渗（300-400mOsm/kg）有益，并被用来提高重组蛋白在CHO细胞中的表达。添加碱、葡萄糖或其他补料会提高渗透压，从而影响产品质量和特殊mAb产品。长时间的培养和培养基的高渗透压会产生高甘露糖型的抗体药物。据报道，鼠杂交瘤细胞系YB2/0产生的mAb其岩藻糖修饰水平，在灌注和流加两种培养模式中，与培养基渗透压成负相关。在285mOsm/kg渗透压时70%岩藻糖修饰，在345mOsm/kg渗透压时40%岩藻糖修饰。pH和渗透压同时变化的情况下，低pH时pH对糖型影响占主导地位，高pH时糖型与渗透压变化相关。终培养基渗透压未发现对CHO-K1细胞系生产的IgG的糖型有显著影响。 以上讨论发现细胞培养过程参数决定了单抗产品的糖型（图 3）。为了阐明各种营养物质的协同作用，基于统计模型的实验设计（DoE）被用来研究各细胞培养参数和原料对终产品糖型的影响。这种研究在对复杂途径产生机械洞察过程中扮演了一个主要角色。糖型分析是鉴别糖型所必需的，糖型需要可控，即便超出可控手头依然有生物手段可以运用。存在太多因素影响细胞动力学从而影响糖型，因此这些在细胞收获阶段所做的分析无法提供有关糖型复杂性的完整信息。 表 2 培养基成分和过程变量对抗体糖基化的影响
因此，对糖基化修饰实时监控有利于在生物工艺过程中履行质量源于设计（QbD）的理念。近期，出现一种新型的实时糖基化修饰监控方法，与超高效液相色谱联用的微顺序注射系统（μSI-UPLC）被用来研究Mn2+浓度对抗体糖型的影响。自动实时结果可以帮助缩短开发时间，因为非预期糖型批次可以较早发现并终止。产品的可比性和生物类似性有着严格的监管要求，实时过程监控是满足该要求的一个先决条件。 糖型是关键质量属性。糖的种类、所占比例变化和单抗分子类型决定了糖型变化所引起的不同影响。在QbD范例中，先前的CQA知识和非临床或临床研究研究的经验对于设定标准和每个CQA可接受范围是有益的。使用合适的工具，如多变量数据分析（MVDA）可以帮助更好得理解从原料研究、过程控制和发展研究中所得数据。就与原研药相似度定义一个设计空间，这样有利于设定可接受范围。表3根据已有知识列出了糖分子可接受的范围，这些已有知识包括体外方法，临床及临床研究（借鉴自A-Mabcase study）。 表3 mAb糖基化修饰可接受范围
（摘自A-Mabcase study） 在对不同批次的Rituximab和Bevacizumab检测发现N-糖型种类存在差异，因此建议在生物类似药开发过程中有必要建立一个稍大的设计空间。Rituximab中，发现N-糖型种类差异如下：末端半乳糖修饰差异近12%，唾液酸修饰差异2.5%，岩藻糖修饰差异2.3%和海藻糖差异1.7%。Bevacizumab类似，末端GlcNac差异最大（13%），次之的是末端半乳糖修饰差异（8%）。因此，评估原研药批间差异有益于为生物类似药研发建立设计空间。 补料策略和培养参数对质量有影响，基于对影响的理解而做出的质量预测与实际量效关系可以通过数学模型弥合。对复杂的糖基化路径系统性的理解有助于模型建立，该模型能将过程水平信息与胞内代谢整合，从而得出糖型结果。有关各种酶的协同作用和动力参数，如亲和常数、解离常数和转运速率等知识需要全面掌握，这些是建立一个稳健的预测终产品糖型模型所需要的。 糖基化修饰的宏观异质性由糖结合位点差异性所致，可由计算机模型根据各种参数如mRNA在ER上的转录速率，糖浓度，糖基转移酶的活性以及蛋白折叠速率来预测糖基化位点。微观异质性依据表达水平和糖基转移酶位置进行计算预测。在替代理论中提出计算机模拟高尔基体作为顺序反应器或活塞式反应器，而蛋白在高尔基体池中保留时间是决定最终糖型的主要因素。在这个模型将来发展中，糖基化过程的动态变化将与哺乳细胞mAb分泌能力及高尔基体池容量相关联。该模型中的最优化策略已经成功运用于生产糖工程改造细胞。该模型进一步改造与细胞生长动力模型相关联，通过考虑到胞外葡萄糖和谷氨酰胺的供给对代谢途径中核苷酸糖合成的影响。近期，高通量微生物培养和核苷酸糖分析技术可以更好地调整和确认构建的细胞生长模型，用来预测时间依赖式的糖型。该工作可以指导理性和精确的过程优化从而获得所需糖型。 药物糖基化是一种独特的翻译后修饰，它们的合成不是模式驱动过程，因此获得一致的糖型是个艰巨的任务。已知糖型对一系列复杂功能具有调节作用，发明易于实时监控糖型的策略是中肯的。除了过程分析具有了显著进步，糖基化水平控制仍是个未实现的目标。生物制药工业及学术研究者们努力弥合该差距，且已经就翻译后修饰复杂性的理解有了很大进步，就各过程变量对糖型的影响以及各聚糖种类对生物药的疗效的影响有所理解。这也明显暗示着在生物类似药开发中，类似药生产企业无法获得原研药相关研发信息。 基于生物药CQA做出的风险评估，有利于制造商在药物开发早期做出英明的决策。在mAbs中，作为质量属性的糖型范围可以通过药物的效应子功能，半衰期，免疫原性和药代动力学/药效估计。比如，无岩藻糖修饰会增强ADCC活性，而唾液酸化会影响mAb分子的抗炎性。因此，根据药物的作用机理和我们对各不同聚糖种类的生物学作用的理解，生物类似药生产企业可以在研发早期根据数据做出决策。这个将会显著降低后期临床试验失败的风险，且提高我们对可比性分析的信任。 因此，利用强大的分析仪器可以实时分析和监控糖基化修饰，比如NMR利用单个氨基酸的分辨率并结合高级统计工具可以对蛋白特征进行分析。另外，数学模型在不久的将来会是一个强大的工具，可以用来预测实时糖基化水平，还可以用来根据培养参数原位调整正在进行的培养过程。随着系统生物学在细胞培养成功运用的出现，一些因子如动力学参数，代谢常数和细胞活力参数可以容易被确立。生物类似药是已存在的生物原研药的一种宝贵的且能负担的替代品，强大的仪器和工具对生物类似药的出现有着显著作用。 作者对来自生物技术部的生物制药技术卓越中心（DBTCentre of Excellence for Biopharmaceutical Technology）的资金（numberBT/COE/34/SP15097/2015）支持表示感谢。另外，申明作者于此无利益冲突。 参考文献： Batra J, Rathore AS. Glycosylation of monoclonal antibody products: Current status and future prospects. Biotechnol Prog. 2016 Sep;32(5):1091-1102. |
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