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糖基化是单克隆抗体和其他重组蛋白的关键质量属性之一，它对抗体效应、安全性和半衰期等都有着重要的影响，研究人员往往要根据其抗体的作用机制和具体特征，利用不同方法以实现合适的糖基化谱。 在上游生产期间，研究人员发现可以通过选择合适的细胞系、基因工程、优化工艺条件（如培养基和添加剂）等方式来改变糖基化谱。目前成功应用基因工程调节治疗型抗体糖基化谱的方法包括：将人α-2,6-唾液酸转移酶1引入CHO、过表达半乳糖基转移酶或唾液酸转移酶、敲除岩藻糖基转移酶8。通过优化工艺条件，如溶解氧（DO）、pH、温度等也会影响产品质量：据报道，减少培养基中的溶氧会降低鼠杂交瘤细胞中产生的IgG1的半乳糖基化。在Muthing等人的实验中发现pH 7.4下观察到半乳糖基化水平达到最高，而pH 7.2下唾液酸化水平达到最高。本篇文章作者主要介绍通过细胞培养基添加剂以调节抗体糖基化谱。 在这项研究中，研究人员选择了两种工业相关细胞系CHO K1和CHO DG44，每种细胞系可以产生特有的IgG1，其具有不同的唾液酸化水平。该研究在旋转管（Spin tube, ST. 不受控制系统）和ambr®15（受控制的生物反应器系统）中进行培养，通过将培养基添加剂补充到细胞培养基中，监测IgG的糖基化谱和细胞培养参数（例如活细胞密度，活力和效价）来评估不同浓度添加剂对IgG糖基化的影响。文章中主要给出了不同添加剂对甘露糖糖基化、岩藻糖糖基化、半乳糖糖基化和唾液酸化水平影响的结果。图1 为不同糖型的分类图。 图2A为在ST（不受控制的系统）和在生物反应器系统ambr®15（受控系统）中培养的CHO K1（mAb1）中产生的IgG1的糖基化谱。图中带斜杠柱形图为受控系统。图2B为在ST（不受控制的系统）和在生物反应器系统ambr®15（受控系统）中培养的CHO DG44（mAb2）中产生的IgG1的糖基化谱。值得强调的是CHO K1产生的mAb1仅含有Fc糖基化，而mAb2显示另外的Fab糖基化。 对于mAb1，受控系统ambr®15与不受控制系统ST相比，IgG平均总半乳糖糖基化增加，第7天、第10天和第12天增加幅度为+ 8.9%、+ 10.7%和+ 11.9%，说明了控制DO和pH能调节IgG的糖基化水平。受控系统中IgG总甘露糖和GlcNAC糖基化水平比未受控系统低，而总岩藻糖糖基化不受培养条件的影响。 相反，培养模式对mAb2的岩藻糖糖基化和甘露糖糖基化几乎没有影响，表明不同细胞系对IgG的糖基化谱会产生稳健的影响。在受控和未受控系统中观察到随培养时间的延长，mAb2总唾液酸化水平减少，而半乳糖糖基化增加。这些数据表明，不同的细胞系、培养系统和培养条件等均会对糖基化谱造成影响。 通过补充不同种类能增加高甘露糖糖型的添加剂，评估不同添加剂对CHO K1细胞系中mAb1的聚糖种类、活细胞积分（IVC）和效价的影响（图3）。结果表明，15uM几夫碱（Kifunensine）添加剂对甘露糖糖基化的影响最大，导致含高甘露糖的糖型种类增加了85.8%，其中糖型Man9增加幅度最大（58.4%）；添加833mM塔格糖（tagatose）可使ST系统中含高甘露糖的糖型种类增加30.3%，其中Man5增加明显（24.0%）；750μ脱氧甘露聚霉素（deoxymannojirimycin）导致含高甘露糖的糖型种类增加28.3%，Man5、Man6、Man7和Man8均增加；而添加甘露糖（200g/L）会增加所有高甘露糖的糖型种类，增加幅度最大的是Man5（13.0%），其原理可能是抑制了内质网和高尔基体中的甘露糖糖苷酶活性。所以可根据我们希望提高的具体高甘露糖糖型，在考虑活细胞和效价的基础之上选择合适的添加剂。 岩藻糖的缺失可显著增强ADCC效应，通过添加特异性降低岩藻糖糖基化的化合物或通过增加非岩藻糖化高甘露糖种类，可以降低岩藻糖基化。图4为降低岩藻糖糖基化的化合物。岩藻糖衍生物（2F-PerAcFuc）是众所周知的岩藻糖基转移酶抑制剂，如图所示比Reactive Red120和MPA能更有效地减少岩藻糖糖基化。研究发现2F-PerAcFuc以剂量依赖性的方式降低岩藻糖糖基化，在最高测试剂量（800μM）降低幅度最大（76.1％）。研究人员认为添加2F-PerAcFuc可能是最有效的降低岩藻糖基化的方法。 图5为不同添加剂对CHO K1细胞系中mAb1半乳糖糖基化、IVC和效价的影响。对照组培养至第12天，IgG总半乳糖糖基化水平约为11.5%，单半乳糖糖基化和二半乳糖糖基化的糖型分别为10.8%和0.7%。添加胞苷（Cyt）、岩藻糖（Fuc）和尿苷（uridine）的混合物、氯化锰（Mn）和Mn、半乳糖（Gal）的混合物均能增加mAb1的半乳糖糖基化水平（图5A）且不影响IVC和效价，其结果说明培养基中Mn离子的浓度以及单独添加Mn离子都不足以实现最大的半乳糖基化。通过添加剂组合的方式，如添加半乳糖（120mM），氯化锰（48μM）和尿苷（24 mM）的混合物能实现最高的半乳糖基化水平（40.9%），且在该条件下活细胞积分（图5B）和mAb1效价都得到提高（图5C），其中尿苷对细胞增殖速率和细胞周期有着重要的作用。如图5所示，100mM氯化铵使总半乳糖糖基化降低了8.6%，对IVC和效价也产生了负面影响，较高浓度的氯化铵（200mM）会导致细胞死亡。 由于产生高的唾液酸化水平建立在增加半乳糖糖基化的基础之上，所以使用半乳糖（120mM），氯化锰（48μM）和尿苷（24 mM）的混合物（以下称为UMG）作为对照组。在CHO DG44细胞系中进行调节抗体唾液酸化的实验，对于mAb2，添加UMG不仅能增加总体半乳糖糖基化（ST第12天，17.6%），总唾液酸化水平也增加了19.0%。为了区分Fab和Fc片段的糖基化结构，用FabRICATOR®消化抗体，分离Fab和Fc片段，结果显示Fc片段几乎不存在唾液酸化（<> 通过在细胞培养基中补充不同的添加剂，与对照组相比mAb2的唾液酸化糖型的总相对量在-3.6%和6.9%之间浮动（图6B）。比较单唾液酸化和双唾液酸化糖型的数量，研究人员发现地塞米松、氢化可的松、CuCl2、200mM ManNAc、和ManNAc +DANA混合物可以降低单唾液酸化糖型抗体，增加二唾液酸化糖型抗体。图6C为添加剂对唾液酸化的定量影响，评估每摩尔抗体中唾液酸化水平。图6D和6E显示了补料分批实验中添加剂对IVC和效价的影响，值得强调的是，与对照相比，糖皮质激素氢化可的松和地塞米松导致IVC减少或不变，而其他添加剂均导致IVC增加。 总结：糖基化是单克隆抗体和重组蛋白的关键质量属性，通过在培养基中补充添加剂可以调节总糖基化的水平和类型，为了对总糖基化水平进行微小调节，还可以通过补充组合添加剂，通过改变添加剂的种类和浓度以得到目标糖基化谱。由于该项研究仅在小规模的反应器中进行，所以在扩大至生产规模前还需要对添加剂进行额外测试。总的来说，细胞培养基添加剂是非常有效的糖基化调节剂，操作起来快速方便、能缩短开发时间，从而降低总体开发成本。 参考文献：Janike Ehret. Martina Zimmermann. et al. Impact of cell culture media additives on IgG glycosylation produced in CHO cells. doi: 10.1002/bit.26904. |
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